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Scientific Reports volume 13、記事番号: 8003 (2023) この記事を引用

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ここ数十年、環境汚染物質が人間の健康に及ぼす悪影響は、深刻な社会的関心事となっています。有機リン酸塩 (OP) 殺虫剤は農業で広く使用されており、OP とその代謝産物が人間の健康に悪影響を与えることが実証されています。私たちは、妊娠中のOPsへの曝露がさまざまなプロセスに影響を及ぼし、胎児に有害な影響を与える可能性があると仮説を立てました。私たちは、母子 PELAGIE コホートから得られた胎盤サンプルにおける性特異的なエピジェネティック反応を分析しました。ゲノム DNA を使用してテロメアの長さとミトコンドリアのコピー数を分析しました。クロマチン免疫沈降、その後の qPCR (ChIP‒qPCR) およびハイスループットシーケンス (ChIP-seq) を使用して H3K4me3 を分析しました。このヒトでの研究は、マウスの胎盤組織分析によって確認されました。私たちの研究により、男性の胎盤はOP曝露に対する感受性が高いことが明らかになりました。具体的には、テロメアの長さの短縮と、DNA損傷マーカーであるγH2AXレベルの増加が観察されました。我々は、ジエチルリン酸（DE）に曝露された男性胎盤では、非曝露胎盤よりもテロメアにおけるヒストンH3K9me3占有率が低いことを検出した。われわれは、DEに曝露された女性の胎盤において、甲状腺ホルモン受容体アルファ（THRA）、8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ（OGG1）、およびインスリン様成長因子（IGF2）のプロモーターにおけるH3K4me3占有率の増加を発見した。 PPARG における H3K4me3 の占有率は、ジメチルリン酸 (DM) に曝露された男性と女性の両方の胎盤で増加しました。選択されたサンプルのゲノムワイド配列決定により、DE 曝露によって誘発される性特異的な差異が明らかになりました。具体的には、女性の胎盤サンプルの免疫系に関連する遺伝子の H3K4me3 に変化があることを発見しました。 DE に曝露された男性の胎盤では、発生関連遺伝子、コラーゲン遺伝子、および血管新生関連遺伝子における H3K4me3 占有率の減少が観察されました。最後に、ヒストン占有率が変化した領域に多数の NANOG および PRDM6 結合部位が観察され、影響がこれらの因子を介して媒介されている可能性があることが示唆されました。私たちのデータは、子宮内での有機リン酸代謝物への曝露が正常な胎盤の発育に影響を与え、幼児期後期に影響を与える可能性があることを示唆しています。

環境要因への曝露が人間の健康に重大な影響を与える可能性があることを示す証拠が増えています。最も有害な影響は、全体的なエピジェネティックな再プログラミング、高い増殖速度、および器官形成事象により、胚への曝露中に発生します。デビッド・バーカーによって定式化されたヒト疾患の発達起源理論（DOHAD）によると、発達の最初の段階で経験した環境条件は、人生の後の段階に長期的な影響を与える可能性があります1。この現象は、発達の生物学的可塑性に関連しており、さまざまな刺激に応じて生理学的機能を簡単に再プログラムすることができます。その結果、子宮内で環境汚染物質に曝露されると、人生の初期段階と後期段階の両方で発生する可能性のあるさまざまな病状に対する素因が増加する可能性があります。

この研究では、有機リン系農薬への曝露の新しいバイオマーカーを明らかにするために、欧州ヒトバイオモニタリングイニシアティブ（HBM4EU）の枠組みの下で、有機リン系農薬（OP）の代謝物のヒト胎盤に対する影響を分析しました。 OP 解毒の一般的な生成物は、ジエチルリン酸 (DE) やジメチルリン酸 (DM) などのジアルキルリン酸 (DAP) であり、これらの代謝産物は通常、質量分析法によって尿中に検出されます 2。研究では、OP への曝露が酸化ストレスの誘発によりミトコンドリアの機能に損傷を与える可能性があることが示されています 3。 OP はホルモン関連のがんを誘発する可能性があり 4、神経系の発達に影響を与える可能性があります 5。小児では、子宮内での OPs への曝露は、男児の認知機能障害や IQ の低下 6、作業記憶指数の欠損など、幅広い発達障害と関連していることが示されています 7。幼少期の有毒物質への曝露の影響は、臍帯血や胎盤などの非侵襲性ヒト生体サンプル中の特定のバイオマーカーを分析することで研究できる可能性があります。胎盤は、胎児循環と母体循環の間の交換プラットフォームとして機能する一過性の器官であり、大量に入手可能です。胎盤は、着床前の胚の胚盤胞期に相当する、受精後約 5 日目に栄養外胚葉 (TE) から発達します。移植後、栄養膜細胞は母親の血管の血管再構築を伴って子宮に侵入し始めます。栄養膜細胞の分化の欠陥は、子癇前症などの妊娠関連の合併症を誘発する可能性があり、乳児の出生体重が低くなる可能性があります8。

GATA39、TEAD410、TCFAP2C11、EOMES12 などの転写因子が初期の TE 特異的遺伝子発現に重要であることが示されています。研究により、多くの胎盤因子が環境ストレスの影響を受ける可能性があることが示されています。たとえば、血管内皮増殖因子 A (VEGFA) の発現は喫煙女性の胎盤でより高く、喫煙に関連する子癇前症の発症リスク増加における VEGFA の役割が示唆されています 13。子宮内でカドミウム、BPA、ポリ塩化ビスフェノールに曝露すると、KISS1 の発現が 3 倍増加することが報告されており、ステロイドホルモン経路への影響が示唆されています 14。新鮮な胎盤から単離され、BPA に 24 時間曝露されたヒト栄養膜層細胞は、増殖阻害とアポトーシスの増加を示し、これらの現象には腫瘍壊死因子アルファ (TNFA) 遺伝子発現とタンパク質レベルの大幅な増加が伴いました 15。したがって、環境毒性物質は、胎盤の発達と機能に関連する遺伝子発現を改変することにより、重要なプロセスの変化を誘発する可能性があります。

発生中のクロマチンリモデリングプロセスの非常に動的な性質により、エピジェネティックメカニズムは発生中に非常に脆弱であることが示唆されています。エピジェネティックなメカニズムは、正確な細胞型特異的遺伝子発現だけでなく、細胞のアイデンティティを保護するためにも不可欠です。エピジェネティックなメカニズムの中で、DNA メチル化が最も研究されています。グッドリッチら。は、鉛、ビスフェノールA、およびフタル酸エステルの代謝産物への幼少期の曝露が、曝露群におけるLINE1の低メチル化とインプリント遺伝子IGF2の過剰メチル化を引き起こすことを示した16。 BPA への曝露は、代謝および酸化ストレスに関連する遺伝子プロモーターの CpG メチル化を低下させました 17。

私たちは、エピジェネティックな制御の変化が正常な胎盤プロセスに影響を与える可能性があると仮説を立てています。エピジェネティックマークのこうした変化は、胎児の発育と成長に重要な遺伝子の発現に影響を与える可能性があります。この研究では、フランス、ブルターニュの母子 PELAGIE コホートのヒト胎盤に対する OP 代謝産物 (DE および DM) への曝露の影響を調査しました。 DM への曝露との統計的に有意な関連性はあまり観察されなかったため、私たちは主に DE 曝露に焦点を当てました。

我々は、子宮内でのOPへの曝露が、男性と女性の両方の胎盤において重要な調節ヒストンの全体的な変化を引き起こすことを示す。これらの変更のいくつかの結果について説明します。私たちのデータは、子宮内での有機リン酸代謝物への曝露が正常な胎盤の発育に影響を与え、幼児期後期に影響を与える可能性があることを示唆しています。

この研究で行われた実験の概要を図S1に示します。テロメアの長さとミトコンドリアのコピー数は、毒物暴露のマーカーとしてよく使用されます。テロメアは、各染色体の両端に位置し、RNA とタンパク質の複合体に囲まれたヘキサヌクレオチドの繰り返しです。テロメアの長さは細胞分裂のたびに減少します。したがって、テロメアの長さは細胞老化のマーカーです18。テロメアは酸化ストレスにより損傷を受ける可能性があるため 19、OP の毒性効果を評価するためにこのマーカーを選択しました。

MtDNA は、毒物によって引き起こされる酸化ストレスがミトコンドリアに損傷を与え、ミトコンドリアの数を減少させる可能性があるため、毒物学研究で使用されるもう 1 つの一般的なマーカーです。 MtDNA は細胞外 DNA であり、核ゲノムが細胞あたり 2 コピーのみを含むのに対し、ミトコンドリアゲノムは細胞の種類に応じて細胞あたり複数のコピー (100 ～ 10,000) 存在します 20。

ゲノム DNA を使用して分析を実行し、mtDNA コピーと TL を RPLP0 遺伝子に対して正規化しました。分析の結果、mtDNA のコピー数は、非曝露男性の方が非曝露女性よりも 1.2 倍高かったことが示されました。ただし、その差は有意ではありませんでした (p 値 = 0.15) (図 1A)。さらに、分析により、男性の方が女性よりもTLが長いことが示されました（p < 0.05、図1A）。

ヒトの男性および女性の胎盤で確認されたコピー数の変異。 (A) 非曝露の男性胎盤では、非曝露の女性胎盤よりも mtDNA コピー数が多く、テロメアが長くなる傾向がありました。 (B) DE への曝露は、女性の胎盤の mtDNA または TL コピーに大きな影響を与えません。 (C) DE に曝露された男性胎盤では TL が減少する傾向があります。 (D) 男性グループにおける gH2AX の定量分析。上、胎盤サンプルの WB 分析の代表的な画像。下、gH2AX の定量分析。各反応で等量の DNA を採取しました。コピー数は RPLP0 遺伝子に対して正規化されました。 *p < 0.05、***p < 0.001、マン・ホイットニー検定。

また、DE 群と非曝露群の mtDNA と TL の差異を男女とも比較しました。DE に反応して、女性では mtDNA または TL コピーの変化は観察されませんでした（図 1B）。 MtDNA コピーは影響を受けませんでしたが、男性の TL は 16% 低下しました (p = 0.07) (図 1C)。

TL の変化は、非常に頻繁に DNA 損傷を誘発する毒性のマーカーである可能性があるため、DE 曝露が DNA 損傷を誘発する可能性があるかどうかを評価しました。 Ser-139 残基上のヒストン変異体 H2AX のリン酸化による ɣH2AX の生成は、二本鎖切断に対する迅速な細胞応答であり、DNA 損傷応答を開始する重要なステップです 21。この目的のために、我々は男性の胎盤からヒストンを抽出し、WBを使用してγH2AXレベルの定量分析を実行しました。定量分析により、非曝露胎盤と比較して、DE 曝露男性胎盤ではγH2AX が有意に増加（1.5 倍）していることが示され、ヒト胎盤に対する DE の遺伝毒性効果が示唆されました（図 1D、S2）。

マイナス要因に対する抵抗力の低下に寄与する可能性のある他の生理学的パラメーターを調べるために、母親の年齢、BMI、喫煙状況を考慮しました。母親の年齢、BMI、喫煙状況を調整した後でも、TL と ɣH2AX は統計的に有意なままであることがわかりました (表 1)。

したがって、テロメア長と gH2AX の分析は、DE がヒト男性の胎盤に損傷を与えることを示唆しています。

H3K9me3 は重要なサイレンシング制御マークであり、テロメア、セントロメア、およびリピート含有領域に豊富に存在します。このマークの規制解除は、除草剤アトラジンへの曝露後に以前に観察されました22。テロメアにおける H3K9me3 の変化がテロメアの不安定性に寄与することが示されているため、我々はテロメアの長さの変化が H3K9me3 の変化と関連しているかどうかを検討することにしました。この目的を達成するために、ChIP‒qPCR を実行し、セントロメア (SATA)、ペリセントロメア (SAT2)、およびテロメア領域 (Tel) のいくつかの要素における H3K9me3 の占有率を分析しました。我々の定量分析により、非曝露男性と非曝露女性との間のセントロメア、ペリセントロメアおよびテロメアにおけるH3K9me3レベルの大きな違いが明らかになった（図2A）。女性の胎盤内の分析されたターゲットでは、H3K9me3 の変化は観察されませんでした (図 2B)。ヒストン H3K9me3 は、SAT2 ターゲットでは有意な変化を示さなかったが、DE に曝露された男性胎盤のセントロメア SATA では減少する傾向がありました (p = 0.1) (図 2C)。女性とは対照的に、DE に曝露された男性胎盤ではテロメアでの H3K9me3 占有率の有意な減少が検出されました (FC = 2.1、p < 0.001)。これは、重要な調節ヒストンマークに対する DE の影響の可能性を示唆しています (図 2C)。

ゲノムの反復領域におけるヒストン H3K9me3 の占有。 (A) H3K9me3 の分析により、非曝露女性胎盤よりも非曝露男性胎盤のサテライトおよびテロメアにおける H3K9me3 の占有率が高いことが示されました。 (B) DE に曝露された女性の胎盤では、H3K9me3 レベルに有意な変化はありませんでした。 (C) 曝露された男性では、テロメアで SATA の減少と H3K9me3 の減少の傾向があった (***p < 0.001、Mann-Whitney 検定)。

重要な発生遺伝子の調節に対する曝露の影響を明らかにするために、我々は、インプリント遺伝子（IGF2）、甲状腺受容体（THRAおよびTHRB）、キスペプチン（KISS1）およびDNA損傷マーカーを含むいくつかの標的におけるヒストンH3K4me3の占有率を分析した。すなわち、8-オキソグアニン DNA グリコシラーゼ (OGG1) です。

我々の分析により、DEに曝露された胎盤は、IGF2、THRA、およびTHRBプロモーターでのH3K4me3をそれぞれ1.7、1.5、および1.6倍増加させたことが明らかになりました（図3A）。女性の胎盤では、DNA修復因子OGG1のプロモーター占有率が1.6倍増加していることが観察されました（図3A）。男性の胎盤は、研究対象の H3K4me3 に有意差を示さなかった (図 3B)。

DE 胎盤の発生遺伝子におけるヒストン H3K4me3 の占有。女性 (A) または (B) 男性の胎盤に対する DE の影響、*p < 0.05、**p < 0.01、Mann-Whitney 検定。

同様に、母親の年齢、BMI、喫煙状況などの他の生理学的パラメーターとデータを比較することにより、データを再分析しました。女性の胎盤では、IGF2、OGG1、およびTHRAの変化が統計的に有意なままであることがわかりました。さらに、母親の年齢、BMI、喫煙状況を調整した後、男性の胎盤におけるIGF2の有意な変化が観察されました（表2）。

また、DM 曝露との関連で H3K4me3 も分析しました。我々の分析により、DMに曝露された胎盤は、女性の胎盤（図S3A）と男性の胎盤（図S3B）で、PPARGプロモーターでH3K4me3をそれぞれ1.8倍と2.8倍増加させたことが明らかになりました。 OGG1 での H3K4me3 占有率は、女性および男性の胎盤でそれぞれ 1.4 倍および 1.6 倍増加する傾向を示しました (両方とも p = 0.06)。

したがって、我々の H3K4me プロモーター占有率分析は、DE および DM への曝露がインプリンティング、甲状腺ホルモン受容体、および DNA 修復因子をコードする遺伝子の変化を引き起こすことを示しました。

ゲノムレベルでの転写調節マークに対する子宮内DE曝露の影響を明らかにし、新たな標的を見つけるために、我々は、女性の未曝露胎盤4個とDE曝露胎盤10個の胎盤由来のクロマチンを用いて、H3K4me3マークのゲノム全体にわたる分布を分析した。男性由来の未曝露胎盤 5 個と DE 曝露胎盤 12 個（詳細は「方法」セクションに記載）。配列決定結果の概要は、すべての配列決定データの Circos プロットに表示されます (図 4A)。非曝露サンプルと比較して、曝露男性サンプルでは H3K4me3 レベルが全体的に減少し、曝露された女性胎盤では H3K4me3 レベルが全体的に増加していることが観察されました。

H3K4me3 の占有率は、ヒト胎盤において世界的に影響を受けています。 (A) Circos プロットは、ヒトにおける大幅に変化した H3K4me3 の領域を示します。プロットは、有意差領域の正規化された log2 倍率変化値を示します。最も内側の Circos ヒートマップは、女性サンプルの差異に関するものです。最も外側のリングは染色体の位置を示します。外側から内側への円形のトラック: 男性サンプルと女性サンプルを比較するときの差分領域のヒートマップ。次のヒートマップは、DE に曝露された男性と対照との差異を示し、最後のプロットは、DE に曝露されたサンプルと対照サンプルの差異領域を示します。異なる領域に位置するいくつかの遺伝子が示されています。 (B) XIST (上) の H3K4me3 は女性の胎盤でのみ検出され、ZFY (下) の H3K4me3 は男性の胎盤でのみ検出されました。

H3K4me3占有率の性特異的な違いを明らかにするために、女性と男性からのすべてのサンプル間の配列データを比較しました（図4A）。主成分（PCA）分析により、男性と女性の胎盤サンプル間の実質的な違いが示されました（図S4A-C）。

また、γH2AXの場合と同様に、非曝露男性および非曝露女性胎盤からの精製ヒストンの定量的WBによって、男性胎盤のH3K4me3タンパク質レベルが高いことも確認しました（図S5A）。私たちの分析は、H3K4me3が男性の胎盤と比較して女性の胎盤で低いことを示しました（図S5B）。

私たちの分析により、1201 個の遺伝子の近くに位置する 817 個のピーク (FC > 2) が男性と女性の間で差次的に発現していることが明らかになりました (図 4A、Circos 図の 2 番目のヒートマップ)。この記事の結論を裏付けるデータセットは記事内に含まれています (補足データセットファイル_1)。女性または男性の胎盤に特有のいくつかの領域を検出しました (表 S1)。たとえば、女性の胎盤はXIST遺伝子にマークを持ち、男性の胎盤だけがZFY遺伝子のプロモーターにH3K4me3マークを持っていることを検出しました（表S1、図4B）。この分析は、世界レベルで、女性は、たとえばNANOS3遺伝子におけるH3K4me3占有率が低いことを示しています（図S6A）。

次に、非曝露の女性と非曝露の男性の H3K4me3 領域の違いが、共通の生物学的機能を共有する遺伝子の近くに位置するかどうかを尋ねました。 GREAT を使用して差分ピーク内の遺伝子を割り当て、プログラム DAVID を使用して機能アノテーションを実行しました。私たちは生物学的プロセスの分析に焦点を当てました。機能的注釈により、差異領域には、特に標準的なWNTシグナル伝達経路遺伝子、細胞運命決定、および血管形成遺伝子の領域が含まれることが明らかになった（図S6B）。

次に、DE への曝露が H3K4me3 占有率の変化を引き起こすかどうかを尋ねました。異なる H3K4me3 は予想どおりプロモーターに局在していました (図 S7A、B)。非曝露雌胎盤と曝露雌胎盤間の H3K4me3 の比較分析では、620 遺伝子付近に位置する 466 領域で H3K4me3 占有率が変化していることが示されました (FC ≥ 2、FDR ≤ 0.16)。この記事の結論を裏付けるデータセットは記事内に含まれています (補足データセットファイル_2)。例えば、占有率の増加は、T 細胞および B 細胞の発生と活性化に重要な役割を果たすタンパク質をコードする VAV1 遺伝子で決定されました (図 5A)。すべての遺伝子の機能的注釈により、白血球による細胞形状の調節および免疫応答の生物学的経路が影響を受けていることが示された（図５Ｂ）。

変化した領域に位置する遺伝子の機能解析。 (A) DE に曝露された女性の胎盤では、VAV1 遺伝子プロモーターの H3K4me3 の占有率が高くなります。 (B) DE に曝露された女性の胎盤で検出された差次的ピークに位置する遺伝子の機能的アノテーションは、生物学的プロセスの観点からの濃縮を示します。 (C) MEIS3 遺伝子および (D) COL5A1 遺伝子のプロモーターでのヒストン H3K4me3 占有率が減少しました。 (E) 露出した男性胎盤の変化した H3K4me3 領域に位置する遺伝子の機能的アノテーション。

曝露された男性では、FC > 2、FDR < 0.05 の 597 遺伝子の近くに位置する 484 の領域が影響を受けていることが判明しました (図 4A)。この記事の結論を裏付けるデータセットは記事内に含まれています (補足データセットファイル_3)。例えば、異なる領域は、正常な発達において重要な役割を果たすホメオボックスHOX遺伝子MEIS1（図5C）、および循環系発達およびコラーゲン組織化にとって重要な遺伝子であるCOL5A1（図5D）に局在していた。機能的アノテーションにより、特に骨格系の発達、血管新生、コラーゲン異化プロセスの強化が示されました（図5E）。

変化したピークを含む領域内に調節 DNA モチーフが存在するかどうかを調べるために、MEME-CHIP24 を使用しました。我々は、DE の雌と雄において転写因子結合部位が濃縮されているかどうかを尋ねた。差分ピークに位置する配列を抽出し、反復マスキングを実行して、分析から反復配列を除去しました。結果として得られた fasta 形式のファイルは MEME-CHIP で処理されました。分析により、DE に曝露された女性および男性の胎盤の差動ピーク間で、有意に濃縮されたモチーフが明らかになりました。たとえば、女性の胎盤でATに富んだモチーフが検出されました（e値 = 8.3e−005）（図6A、下）。モチーフの一部は NANOG 結合部位に類似しています (p 値 3.35e-04、q 値 = 1.18e-01) (図 6A、上)。他の同定されたモチーフは、図S8のMEMEモチーフの完全なリストであるARに類似していました。

女性または男性の胎盤の異なるピークに位置する領域のモチーフ分析。 (A) DE に曝露された女性胎盤の差次的 H3K4me3 ピークで AT に富むモチーフ (下) が検出され、モチーフの一部は NANOG (上) と類似しています。 (B) DE に曝露された男性胎盤の差次的 H3K4me3 ピークで T リッチモチーフが同定され (下)、モチーフの一部は PRDM6 結合部位 (上) に類似しています。破線の四角は、転写因子結合部位に一致するモチーフの部分を示します。 (C) 同定された PRDM6 結合部位は、DE に曝露された男性胎盤の COL5A1 遺伝子で検出され、PRDM6 モチーフは緑色で示されています。この配列はマウスとヒトのゲノム間で保存されています。

男性の胎盤では、T-richモチーフが検出され（e値= 1.0e-010）、発見された濃縮モチーフ配列の一部はPRDM6結合部位に類似していました（図6B）（p値6.98e-07、 q値 = 5.40e−04)。例えば、T-richモチーフがCOL5A5遺伝子で見出された(図6C)。他の同定されたモチーフはSP1/2およびVEZF1因子に類似しており、MEMEモチーフの完全なリストは図S9にあります。

胎盤における性特異的な違いを確認するために、マウスの胎盤で特定されたヒトの標的を分析しました。胎盤が十分に形成されている胎生15.5日目にマウスを解剖した。胎盤サンプルの性別は、一致する胚の生殖腺の分析によって決定されました。胎盤をパラホルムアルデヒドで固定し、組織をパラフィンに包埋し、H&E 染色切片の組織形態を分析しました（図 S10）。男性と女性の両方の胎盤は同様の形態を持っていました。

ヒトの胎盤ではメスよりもオスの方が高いレベルの H3K4me3 が存在することが確認されたため、マウスにも同様のパターンがあるかどうかを調べました。この目的を達成するために、H3K4me3 に対する抗体を使用して切片の免疫蛍光染色を実行しました (図 7A)。多数の細胞において H3K4me3 の定量分析を実行しました。分析の結果、H3K4me3 は雄で有意に高いことが示され (図 7B)、マウスとヒトにおけるヒストン占有率の一貫性が示唆されました。

マウス胎盤における性別特異的分析。 (A) 男性胎盤の H3K4me3 強度は女性胎盤よりも高い。女性または男性の胎盤の性別は、胎生日 (E15) での胚の解剖によって識別されました。胎盤をパラホルムアルデヒド溶液で固定し、切片を作成しました。切片をH3K4me3抗体で免疫染色した。同じ露光時間で画像を撮影し、フィジーを使用して生物学的複製ごとに 150 個の細胞からの蛍光レベルを分析しました。 (B) H3K4me3 蛍光を DAPI シグナルに対して正規化し、平均値をプロットして正規化蛍光として示しました。 20 × 対物レンズ、各グループの n = 4。 (C) 胎盤遺伝子発現は性的二型を示します。 E15 の男性および女性の胎盤から RNA を抽出し、cDNA を生成して RT‒qPCR に使用しました。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子 Rpl37a に対して正規化されました。各グループ n = 8、*P < 0.05、**P < 0.01 ***P < 0.001、マンホイットニー検定。

次に、ヒストン占有率の性特異的な変化が遺伝子発現を伴うかどうかを明らかにするために、性特異的な違いを示したターゲットの RT‒qPCR 分析を実行しました。私たちは、栄養膜形成に重要な役割を果たすタンパク質因子をコードする重要な遺伝子 (Gata6、Ppara、Pparg、Tbx2、Cdh2、Irx3、Nanos3、および Eif5) と、細胞骨格に重要な因子 (Actg1) を含むすべての細胞型で発現する遺伝子を選択しました。アポトーシス (Bnip3)、DNA 修復 (Alkbh3 および Ogg1)、血管形成 (Vegfa および Cdh2)、およびエピジェネティクス (Ezh2)。分析の結果、栄養膜機能に重要な遺伝子における性特異的な違いが示されました。 Gata6、Nanos3、Ezh2、Ppara、Pparg、および Eif5 の遺伝子発現 (図 7C) は男性の方が高く、ヒトの H3K4me3 マーク占有率と同様でした。私たちは、女性のヒト胎盤における XIST のプロモーターに H3K4me3 マークが存在するのと同様に、Xist mRNA が女性でのみ発現していることを確認しました。

したがって、マウス胎盤における遺伝子発現の分析により、ヒストン H3K4me3 占有率における性特異的な変化が示されました。

我々は、DE への曝露がテロメア長の変化を引き起こすことを観察しました。いくつかの研究は、ストレス要因がTLの変化を引き起こすことを示しています。たとえば、タバコ作物に農薬を使用すると、TL が短縮されます。Kahl et al.25。別の殺虫剤であるマラチオンの使用も TL の短縮につながりました (p = 0.03)。Andreotti et al.26。酸化ストレスもテロメアの損傷と短縮に寄与する可能性があります19。 γH2AXの増加と8-オキソグアニングリコシラーゼ（OGG1）のヒストン占有率の増加が観察されたため、グアニンの酸化と全体的なDNA損傷を介したテロメア短縮におけるDEの潜在的な役割を想像できます。

一方で、テロメアの繰り返しを伸長させる酵素活性（テロメラーゼ[TERT]）の変化がテロメアの伸長または短縮に関連している可能性があることが示唆されています。 TERT の活性は IUGR 胎盤で観察され、テロメア短縮は hTERT mRNA 発現の減少によって説明されます 27。 TL の減少は、通常はヒストン H3K9me3 マークによって維持されているテロメアの安定性の変化によっても説明できる可能性があります。男性のDEに反応してテロメア領域でH3K9me3が減少することを観察しました。テロメア転写物 TERRA の発現を制御するには、テロメアにおける H3K9me3 レベルの上昇が必要であることが示唆されています。過剰に、TERRA の発現増加はテロメアの短縮につながります 28。この示唆は、H3K9me3 密度の増加がテロメアが長くなるほど検出されるという証拠によって裏付けられました 28。この規制の正確なメカニズムはよくわかっていません。

テロメアにおける H3K9me3 の減少は、H3K9me3 を導入する酵素 (SUV39H1/H2 など) の活性の低下が原因である可能性があります。たとえば、従来の熱処理技術中に一部の食品に形成される化学汚染物質であるフランへの曝露は、SUV39H1 および SUV39H229 の大幅なダウンレギュレーションを引き起こします。同様に、これらの酵素の活性の変化が H3K9me3 レベルの低下の原因である可能性があることを示唆します。この接続を確認するには、さらに作業が必要です。

女性の胎盤と比較して、男性のテロメアリピートでより高いレベルの H3K9me3 が検出されました。この現象は、男性の胎盤ではテロメアが長いため、より多くの H3K9me3 がテロメアに関連付けられている可能性があるという事実によるものである可能性があります。

したがって、我々の観察は、DEへの曝露がテロメアのH3K9me3に影響を与え、これがテロメア短縮の原因である可能性があることを示唆しています。

私たちは、女性の胎盤の IGF2 における H3K4me3 の増加を特定しました。 IGF2 は刷り込まれた父親由来の発現遺伝子であり、その機能は栄養膜細胞における母親から胎児への栄養素の移動を調節することです 30。 IGF2 によってコードされるタンパク質は、胎盤内のホルモン依存性経路で役割を果たしています 31。エタノールに曝露されたヒト胎盤では IGF2 レベルの上昇が検出され 32 、これは有毒な条件下では単一対立遺伝子発現の保存が混乱するか、母親から子供への栄養経路が損傷されることを示唆しています。

女性におけるTHRA H3K4me3占有率の増加が観察されました。甲状腺ホルモン (TH) は、胚および胎児の正常な発育に不可欠です。妊娠期間中、TH は胎盤を介して母親から提供されます。妊娠後期になると、胎児甲状腺の寄与が増大します。栄養制限されたヒツジの胎盤では THRA mRNA の発現増加が観察され、この遺伝子発現の増加は、栄養制限されたヒツジの母体血中の T4 および T3 濃度の低下を補おうとする取り組みであることが示唆されました 33 。

我々は、DEに曝露された男性において、コラーゲン異化プロセスに関係する遺伝子を含む多くの発生遺伝子の変化を特定した。母体と胎児の境界面でのコラーゲンの高発現は、脱落膜における免疫細胞の分化と機能を調節することによって免疫寛容微小環境を誘導する可能性があり、これは着床と妊娠の成功に重要です。研究では、COL4A1 と COL4A2 が母体の子癇前症感受性遺伝子として特定されました 34。したがって、コラーゲン関連遺伝子におけるヒストン H3K4me3 の変化は、妊娠合併症のリスクを高める可能性のある胎盤微小環境プロセスの混乱を反映している可能性があります。胎盤細胞型の細胞形態および形状における DE の役割を決定するには、さらなる研究が必要です。

我々は、多能性幹細胞で高度に発現している、変化したH3K4me3ピークにNANOGの多数の結合部位を観察した。 NANOG は、おそらくアポトーシスと細胞遊走に対する影響を通じて、妊娠性栄養膜疾患の病因に関与していると仮定されています 35。 NANOG の活性化は胎盤の成長問題に関係している可能性があり、その調節が妨げられて胎盤の病状の一因となる可能性があります。

一方で、多数のピークに PRDM6 の結合部位があることがわかりました。この遺伝子は、血管前駆体によって発現される転写抑制遺伝子をコードしています 36。 PRDM6 は、クラス I ヒストン脱アセチル化酵素および G9a ヒストンメチルトランスフェラーゼと相互作用することによって転写抑制活性を示すことが示されています 37。 PRDM6 はヨーロッパ系の人々の収縮期血圧と有意に関連していることが判明し 38、PRDM6 の変異は一般的な先天性心疾患の原因となります 39。したがって、PRDM6 は血管形成と心臓の発達に重要なエピジェネティックなサイレンシングにおいて重要な役割を果たしている可能性があります。したがって、PRDM6 は、我々の研究で男性の胎盤で観察された活性化ヒストン H3K4me3 の全体的な減少に関与するタンパク質としての強力な候補です。

胎児と胎盤は父親の抗原を発現します。母親の免疫系によって認識されますが、全身免疫応答と局所（子宮）免疫応答の両方の変化は、正常な細胞傷害性適応反応を無効にし、一方で制御性の寛容原性反応を強化し、妊娠の進行を可能にします。サイトカイン、成長因子、ホルモンシグナル伝達経路は、着床と出産の間に重要な役割を果たします。妊娠により、感染に対する特有の感受性が高まります。感染性病原体は、妊娠合併症や感染による胎児の寛容性の混乱の引き金となることがますます重要になっています。観察された免疫系遺伝子の変化により、男性胎盤の感染に対する感受性が高まる可能性があると我々は示唆している。

私たちのデータは、男性の胚が環境要因に対して子宮内でより脆弱であるという以前の観察を裏付けていますが、この性差の基礎となるメカニズムはまだ明らかではありません40。 Cviticらの研究によって裏付けられた意見がある41。これは、男性の母子相互作用には免疫適合性が低く、それが雄胎児のより高い免疫反応を引き起こし、その結果炎症誘発状態を引き起こす可能性があることを示唆している。

ヒトの生体サンプルでは、mRNA 発現や転写因子をコードするタンパク質を分析することはできませんでした。母親の特徴（年齢、体格指数、喫煙状況）をある程度調整した後でも我々の結果が同様であったとしても、データのばらつきが大きいことは、人間が幼少期にさらされる他の測定されていない要因の寄与によって説明できる可能性がある。この研究により、有機リン酸代謝物のヒト胎盤に対する悪影響をより深く理解するために、動物または細胞培養モデルを使用してさらに確認および研究する必要がある新しいバイオマーカーとターゲットが明らかになりました。本研究のもう 1 つの限界は、単一の尿サンプルを使用した OP 曝露評価に関連しています。 OP の生物学的半減期は短く、数時間から数日で急速に除去されます。したがって、OP 尿中濃度には個人内で日次および日内変動があります。したがって、グループは露出の誤分類が起こりにくく、背景の露出レベルをよりよく反映していると仮定して、露出変数を二分化することを選択しました。

私たちのデータは、OP 代謝物への曝露が曝露に応じて性特異的な差異を誘発し、胎児の成長と発育に影響を与える可能性があることを示唆しています。同定された新しい因子は、OP への曝露のバイオマーカーとしてさらに調査される可能性があります。

すべての方法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。この研究では、有機リン系殺虫剤への曝露の新しいバイオマーカーを明らかにするために、ヒト胎盤に対する有機リン酸系 (OP) 農薬の代謝物の影響を分析することを目的としました。母子 PELAGIE コホートから 94 個のヒト胎盤サンプル（男性 46 人、女性 48 人）が得られ（「方法」セクションを参照）、妊娠 19 週間前の母親の尿サンプルで DE および DM の濃度が測定されました（図.S11とS12）。 ChIP‒qPCR 法を使用して、胎盤サンプルのゲノム DNA のミトコンドリア (mt) DNA とテロメア長 (TL) コピーを分析しました。私たちは、セントロメアサテライトアルファ (SATA) およびペリセントロメアサテライト 2 (SAT2) DNA、およびテロメア領域における H3K9me3 の占有率を調査しました。すべてのサンプルの選択されたターゲットでのヒストン H3K4me3 の占有率を分析しました。標的として、胎盤の発達に重要な遺伝子 (PPARA、PPARG、および KISS1) および機能に重要な遺伝子 (IGF2、PGR、THRA、および THRB) を選択し、酸化ストレスのマーカー (OGG1) を研究しました。曝露のバイオマーカーとして機能する可能性のある OP の新しい標的を明らかにするために、選択されたサンプルの小グループでゲノム全体の分析を実行しました。マウス胎盤では、形態、グローバルヒストン H3K4me3 レベル、および遺伝子発現を胎生 15 日 (E15) で分析しました。

PELAGIE (Perturbateurs Endocriniens: Étude Longitudinale sur les Anomalies de la Grossesse、l'Infertilité et l'Enfance) コホートは、2002 年から 2006 年にかけてブルターニュ (フランス) の一般人口から募集された母子コホートです。妊婦も含まれていました。婦人科医、産科医、または超音波検査技師による妊娠の最初の診察中に。参加の基準の 1 つは、妊娠 19 週未満の妊娠であることです。研究対象集団では、参加時 (= 採尿時) の在胎週数は在胎 6 週から 15 週の範囲で、中央値は 11 でした。

朝一番の排尿サンプルは、妊娠 19 週以前に各妊婦から 1 回だけ採取されました。このサンプルには、多数の OP 殺虫剤の 6 種類の非特異的ジアルキルリン酸 (DAP) 代謝物 [ジエチルリン酸 (DEP)、ジエチルチオリン酸 (DETP)、ジエチルジチオリン酸] が含まれていました。（ＤＥＤＴＰ）、ジメチルホスフェート（ＤＭＰ）、ジメチルチオホスフェート（ＤＭＴＰ）、およびジメチルジチオホスフェート（ＤＭＤＴＰ）］を測定した。化学分析は、固相抽出 (SPE) および液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析 (LC/MS-MS) を使用して、LABOCEA Institute (フランス、プルザネ) によって実施されました。品質管理/品質保証の手順や設備などの詳細は、以前の著作で提供されています42。妊娠中の女性は、人口統計、職業、医学的特徴、食習慣やライフスタイルなどを含むアンケートに回答するよう求められました。研究対象集団の特徴を以下の表に示します (表 3)。

研究対象集団には健康な参加者が含まれており、母親のほとんどがBMIが正常範囲内（77％）、高学歴（68％が大学卒業）、妊娠初期に喫煙者がほとんどいなかった（15％）。）。フランスでは民族に関するデータは収集できませんが、両親が非ヨーロッパ出身である母親は 1 人だけであることがわかっています。同様に、新生児の健康状態は良好で、早産はなく、平均出生体重は 3,426 g です (6 人の子供は在胎期間の割に小さく生まれました)。全体として、DM 曝露と出生体重との間の負の相関 (スピアマン相関 = − 0.21、p = 0.049) と大学卒業女性の DE レベルの高さ (DE 中央値 = 0.65) を除いて、これらの特徴と DM または DE レベルの間に関連性はありません。 nmol/L) (中央値 DE ≤ LOQ)。

出生時には、母子記録やその他の生物学的サンプルからデータが収集されました。サンプルには、臍帯移植点にできるだけ近い 10 cm3 の長方形の胎盤が含まれており、-80 °C で冷凍されました。 6 歳のとき、OP を含む潜在的な神経毒物質への出生前曝露が子どもの認知能力に及ぼす役割を研究するために、子どもの神経心理学的検査が組織されました 42,41,44。この検査では、神経心理学的発達への影響が十分に確立されている重大な健康上の問題（例えば、重度の早産状態、特定の遺伝子異常）を有する双子および小児は除外された。この検査の参加者94人のサブグループが、本研究のために選択された。その中には、出生から6歳までのPELAGIEコホートの追跡調査への参加が最も多く、胎盤サンプルが入手可能な参加者（コホートの約60％）も含まれている。 : 女子48名、男子46名。この研究では、これらの胎盤サンプルのそれぞれを 4 ～ 6 つの異なる場所で切断し、これらの断片を細かく切り刻んで各サンプルの均一な細胞組成を取得しました。切り刻んだ胎盤サンプルは、使用するまで -80 °C で保存しました。尿中代謝産物濃度は、1 リットルあたりのマイクログラムからモル濃度 (1 リットルあたりのナノモル) に変換されました。全体の DE 濃度は、DEP、DETP、および DEDTP の濃度の合計から得られました（図 S11、表 4）。 DM 濃度は、DMP、DMTP、および DMDTP の濃度の合計として得られました（図 S12、表 4）。母体尿サンプルの化学分析の定量限界 (LOQ) は、DEP、DETP、DEDTP、DMP、DMTP、および DMDTP についてそれぞれ 1.25、1.7、0.02、0.2、1、および 0.45 μg/L でした。 LOQ での変動係数はそれぞれ 19、19、20、17、19、20% でした。

DNA抽出は、DNeasy Blood & Tissueキット(Qiagen)を製造業者の指示に従って使用して実施した。 DNA 抽出には、RNA の存在を避けるための RNAse A 処理ステップが含まれています。 DNAの濃度は、QuantiFluor dsDNAシステム(Promega)を使用して測定した。 DNA の品質は、サンプルを 0.7% アガロースゲル上で泳動することによって評価され、各サンプルの単一のバンドが観察されました。 DNA の品質は、1.8 を超える A260 と A280 の比によっても確認されました。

抽出したゲノム DNA を 0.1 ng/μL の濃度になるように希釈し、等量の抽出したゲノム DNA を qPCR に使用しました。 384 ウェルプレートを使用して定量 PCR を実行しました。各ウェルには、5 μL の SYBR® Green Master Mix (Bio-Rad)、0.05 μL の各プライマーペア (100 μM ストック溶液)、0.9 μL の H2O、および 4 μL の DNA テンプレートが含まれていました。 qPCR は、CFX 384 リアルタイムシステム (Bio-Rad) を使用し、2 段階のプロトコールで実行されました: 98 °C で 30 秒間の初期変性、続いて 98 °C で 15 秒および 65 秒間の 40 増幅サイクルプログラム1分間融解プログラムは、PCR プログラムの後に実行されました。正規化された発現値は、参照遺伝子として RLP0 を使用し、384 CFX Bio-Rad マシンによって提供される内部 CFX Manager プログラムを使用して計算されました。この研究で使用したプライマーを表 S2 に示します。

ヒストン抽出は、ab113476-ヒストン抽出キット(Abcam)を使用して、製造業者の指示に従って実施した。簡単に説明すると、各サンプルから等量の胎盤 (約 100 mg) を収集し、金属ビーズと TissueLyser II (Qiagen) を使用して均質化し、続いてペレットを遠心分離および溶解して、上清中のヒストンなどの非常に塩基性のタンパク質を単離しました。タンパク質濃度は、Pierce 660 nm Protein Assay (Thermo Scientific) を使用して推定しました。

ウサギポリクローナル抗体抗ヒストンγH2AX (Trevigen、4411-PC-100、1:1000希釈)を使用してウェスタンブロットを調製しました。 10 mM Tris 緩衝液および Laemmli 4X 緩衝液中の同量のヒストンタンパク質 (10 μg) を変性させ、4 ～ 15% 勾配 SDS‒PAGE ゲル (Mini-PROTEAN® TGXTM プレキャストタンパク質ゲル) 上で泳動しました。エレクトロブロッターシステム (TE77X、Hoefer、米国) を使用して、タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Millipore、フランス) に 1.15 時間転写しました。ブロッキングは、1X TBS Tween 0.05% 中の 5% ミルクを使用して実行されました。一次抗体を 10 mL のブロッキング溶液で希釈し、メンブレンを 4 °C で一晩インキュベートしました。 1X TBSで10分間3回洗浄した後、各メンブレンを、対応するHRP結合二次抗体（GE Healthcare、米国）を含むブロッキング溶液40 mL中で1時間インキュベートしました。さらに 1 × TBS で 10 分間洗浄を 3 回行った後、ウェスタンブロッティング検出試薬 (Amersham ECLTM Prime Western blotting Detection Reagents) を使用して、一次抗体複合体および二次抗体複合体の開発のために各膜をコーティングしました。次に、分子イメージャー (Image LabTM ソフトウェアを備えた ChemiDocTM XRS + システム) を使用して、抗体の特異的なタンパク質発現を写真撮影しました。ポンソーレッドで染色した H3 ヒストンバンドを使用して、各サンプルの γH2AX のレベルを正規化しました (図 S2)。バンドの強度は、Fiji:ImageJ ソフトウェアで測定されました。

H3K4me3 (Millipore、07-473) または H3K9me3 (Abcam、ab8898) に対するウサギポリクローナル抗体を使用して ChIP を実行しました。各胎盤サンプルから等量の物質 (約 50 mg) を秤量し、1% パラホルムアルデヒド溶液中で 10 分間インキュベートして、タンパク質を DNA に架橋結合させました。次に、100 μL の 1.25 M グリシンを各サンプルに添加して、結合していないパラホルムアルデヒドをクエンチしました。サンプルを遠心分離し、1 mL の PBS と 2 つの金属ビーズをペレットに加え、TissueLyser (Qiagen) を使用してホモジナイズしました。次に、サンプルをセルストレーナーで濾過し、得られた溶液をペレット化し、次のバッファーに再懸濁しました: 0.25% (vol/vol) Triton X-100、10 mM EDTA、0.5 mM EGTA、および 10 mM Tris、pH 8. サンプルを 1100 rpm、4 °C で 5 分間遠心分離し、細胞を含むペレットを 300 μL の SDS 溶解バッファー (1% (wt/vol) SDS、10 mM EDTA、および 50 mM Tris-HCl) に再懸濁しました。、pH 8）プロテアーゼ阻害剤を補充しました。クロマチンを SDS 溶解バッファー中で 60% 振幅で 8 分間超音波処理しました (20 秒オン、20 秒オフ、431C2 カップホーンを備えた Qsonica 700 超音波処理装置)。これらのパラメーターにより、約 300 bp のフラグメントを取得することができました。超音波処理後、サンプルを 12,800 rpm、4 °C で 10 分間遠心分離し、超音波処理したクロマチンを含む上清を移し、1.7 mL の次の緩衝液を使用して希釈しました: 0.01% (1.1% (vol/vol) Triton X-100) 、1.2 mM EDTA、16.7 mM トリス-HCl、167 mM NaCl）。 20 μL の Dynabeads (10002D、Invitrogen) とヒストン標的に特異的な抗体を含む溶液をサンプルチューブに加え、4 °C で一晩インキュベートしました。抗体と Dynabeads を添加する前に、各サンプル 10 μL を「入力サンプル」(出発物質) として収集しました。

Dynabeads および目的の抗体と一晩インキュベートした後、ビーズを次の 4 つのバッファーでそれぞれ 5 分間洗浄しました: (1) 低塩バッファー: 0.1% (wt/vol) SDS、1% (vol/vol) Triton X -100、2 mM EDTA、20 mM トリス-HCl、150 mM NaCl; (2) 高塩緩衝液: 0.1% (wt/vol) SDS、1% (vol/vol) Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl、pH 8、500 mM NaCl。（３）ＬｉＣｌ緩衝液：０．２５ＭＬｉＣｌ、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）イゲパル、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）デオキシコール酸； (4) TE バッファー (2 回洗浄)。

洗浄ステップの後、ビーズを 1% (wt/vol) SDS および 0.1 M NaHCO3 (pH 9) を含む 50 μL 溶液で 2 回処理し、65 °C で 15 分間インキュベートして沈殿したクロマチンを溶出しました。ビーズ。続いて、9μLの5M NaClを添加し、65℃で4時間インキュベートすることにより、溶出したクロマチンを逆架橋させた。次に、プロテイナーゼ K を添加し、サンプルを 45 °C で 1 時間インキュベートすることによってタンパク質を除去しました。沈殿したDNAをMiniElute Reaction Clean-Upキット(Qiagen)で精製し、QuantiFluor dsDNAシステム(Promega)を使用してDNA濃度を測定した。最小約 5 ng の DNA が得られました。

等量の沈殿した DNA (0.4 ng) と入力サンプルを qPCR 分析 (0.1 ng/μL) に使用しました。定量的 PCR は前述したように実行されました。正規化された発現値は、プロモーターから遠く離れた領域を参照遺伝子として使用し、384 CFX Bio-Rad マシンによって提供される内部 CFX Manager プログラムを使用して計算されました。 H3K4me3-ChIP 正規化には GAPDH の領域を使用し、H3K9me3-ChIP には RPLP0 の領域を使用しました。沈殿した DNA における各ターゲットの濃縮は、正規化された ChIP DNA コピーの平均とインプット内の正規化された DNA コピーの平均との比を計算することによって評価されました。

読み取りの品質管理は FastQC v0.11.7 を使用して実行されました。シーケンスリード情報を表 S2 に示します。サンプルごとの読み取り数が表示されます。リードは、Bowtie (v1.2.3)45 (コマンドラインパラメーター: -m1-best-strata-v3) を使用してヒト GRCh38 リファレンスにアライメントされ、SAMtools (v1.13)46 を使用してソートされ、バイナリファイル (BAM) に直接変換されました。 PCR の重複リードはマークされ、SAMtools を使用して削除されました。 ChIP-seq トラックを視覚化するために、BEDtools バージョン v2.27.147 の GenomeCoverageBed 関数を使用して Bedgraph トラックを生成しました。 IGV を使用してトラックを視覚化しました48。

対照群と治療群における H3K4me3 領域の差次的濃縮は、csaw (v1.26.0) パッケージ 49 を使用して実行されました。まず、spacing = 50、width = 150、bin = FALSE パラメーターを指定して windowCounts() を使用して、完全なゲノムのリード数をカウントしました。次に、normFactors() を使用して正規化係数を計算しました。次に、edgeR パッケージ (v3.34.0)50 のestimateDisp () と glmQLFit () を使用して、差分領域の log2 倍変化、p 値、および FDR を計算しました。有意に異なる領域は、FDR < 0.05 で選択されました。

R の RCircos (バージョン 1.2.2) を使用して、正規化された log2 倍率変化値の circos ヒートマップを生成しました51。遺伝子機能アノテーションバブルマップは、色分けされた自家製 R スクリプトによって生成されました。色が濃いほど、p 値は小さくなります。ドットの大きさは遺伝子の割合を表します。

ディファレンシャル H3K4me3 領域のリピートマスクシーケンスは、RepeatMasker52 バージョン open-4.0.9 によって実行されました。モチーフの識別は、MEME-ChIP24 をデフォルトのパラメーターで使用して実行されました。同定されたモチーフは、TomTom53 を使用して既知のモチーフと比較され、Find Individual Motif Occurrences (FIMO) を使用してモチーフ結合部位をスキャンしました 54。

異なる領域は、ChIP-seq 領域を遺伝子に割り当てた GREAT55 によって分析されました。遺伝子リストは DAVID56,57 に提出されました。 DAVID の「機能アノテーションチャート」オプションを使用して分析を実行しました。ここでは、デフォルトのパラメーターで「GOTERM_BP_DIRECT」を選択しました。

異系交配スイスマウス (RjOrl:SWISS) は Janvier lab から購入しました。マウスは、標準的な動物舎条件下の動物施設で飼育された。繁殖後、膣栓が検出された日を胎生0.5日(E0.5)とみなした。妊娠中の雌は、胎盤が十分に発達している在胎日 E15.5 に解剖されました。少なくとも 3 匹の独立した同腹仔から生まれた動物をすべての実験に使用しました。

RNA分析のために、E15の4匹の妊娠マウスからの胎盤を解剖した。胎盤の性別は、一致する胚の生殖腺を分析することによって決定されました。メーカーの指示に従って、RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) を使用して全 RNA を抽出しました。このキットには DNA 除去ステップが含まれています。逆転写は、iScript™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) を使用して 1 μg の RNA で実行されました。得られた cDNA を 10 倍に希釈し、定量的 RT-qPCR に使用しました。 RT‒qPCR に使用されるプライマー配列を補足表 S3 に示します。 RT‒qPCR は、CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) の製造元の指示に従って、iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) を使用して実行されました。定量化サイクル (Cq) 値は、384 CFX Bio-Rad マシンによって提供される内部 CFX Manager プログラムを使用して計算されました。 Rpl37a cDNAのCq値を正規化に使用しました。データは分析され、対照と比較した平均倍率変化 (FC) 値 ± SD、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 として表示されます。

免疫染色のために、男性または女性の胎盤を 4% (w/v) PFA 溶液で 16 時間固定し、脱水してパラフィンに包埋しました。切片を脱パラフィンして再水和し、0.01 M クエン酸緩衝液 (pH 6) 中で 80 °C で 45 分間エピトープのマスクを解除しました。 1X PBS-0.05% Tween (PBS-T)で洗浄した後、切片をウサギ抗H3K4me3抗体(1:500、Merck Millipore、07-473)とともにインキュベートした。 H3K4me3 一次抗体 (1:500、Millipore 07-473) を含む切片を、加湿チャンバー内で 4 °C で PBS-T 中で一晩インキュベートしました。 PBS-T で洗浄した後、切片を適切な蛍光二次抗体 (1:500) とともに加湿チャンバー内で室温で 1 時間インキュベートしました。切片を 0.001% (v/v) 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) で対比染色し、VECTASHIELD 溶液を使用してマウントしました。画像は、AxioCam MRc5 カメラと 20 倍の対物レンズを備えた AxioVision ソフトウェアバージョン 4.8.2 (Zeiss、ドイツ) を備えた AxioImager 顕微鏡を使用して取得しました。反復ごとに少なくとも 6 枚の画像を分析し、ImageJ v1.52n を使用して細胞内のシグナル強度を定量しました。細胞のない領域を使用して背景を差し引きました。 H3K4me3 の平均強度を測定し、DAPI のシグナル強度に対して正規化し、正規化された平均蛍光として計算しました。

尿中濃度を 2 つのグループに分類しました。DE の場合は尿サンプル中の検出されない値と検出された値、DM の場合は中央値以下と中央値を超えています。マン・ホイットニー検定を使用して、2 つのグループ間の関連性を比較しました。胎盤機能に影響を与える可能性のある母体の特徴の結果と制御を強化するために、マン・ホイットニー検定で観察された関連性について多変量線形回帰モデルを追加で実行しました。したがって、母親の年齢、BMI（> 25 vs. ≤ 25 kg/m2）、喫煙（はい vs いいえ）をモデルの独立変数として考慮した多変数線形回帰を適用しました。

研究手順は、人間を対象とした生物医学研究について倫理委員会によって承認されました。すべての参加者および/または法的保護者からインフォームドコンセントを得ました。成人被験者は書面によるインフォームドコンセントを与え、6歳児は口頭および目撃による同意を与えた。フランス国家コンピュータ化秘密委員会の倫理委員会は、すべての研究手順を承認しました (No. 902076)。

動物を使用するすべての実験手順は、フランス国立教育研究省によって認可されました (番号 APAFIS#17473-2018110914399411 v3)。本研究に使用される動物施設は、フランス農業省によって認可されています (協定 D35-238-19)。すべての実験手順は、実験動物の管理と使用に関する省の研究ガイドに概説されている倫理原則に従い、地元の動物実験倫理委員会 (C2EA-07) によって承認されました。すべての方法はARRIVEガイドラインに準拠しました。

この研究からのすべてのシーケンスおよび ChIP-seq データは公的に利用可能であり、国立バイオテクノロジー情報センター遺伝子発現オムニバスに寄託されています。 GEO 番号は GSE209943 です。この記事の結論を裏付けるデータセットは、[GEO] リポジトリ [GSE209943] およびデータセットへのハイパーリンク https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc で入手できます。 cgi?acc=GSE209943。

有機リン酸塩

アクチンガンマ1

AlkB ホモログ 3、α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ

アンドロゲン受容体

BCL2相互作用タンパク質3

カドヘリン2

コラーゲン IV 型アルファ 1 鎖

コラーゲン IV 型アルファ 2 鎖

コラーゲン V 型アルファ 1 鎖

リン酸ジアルキル

注釈、視覚化、統合された検出のためのデータベース

ヒト疾患の発生起源説

リン酸ジエチル

リン酸ジメチル

真核生物の翻訳開始因子 5

エオメソデルミン

zeste 2 ポリコーム抑制複合体 2 サブユニットのエンハンサー

GATA結合タンパク質3

アノテーションのゲノム領域強化ツール

欧州連合のための人間の生体モニタリング

インスリン様成長因子 (IGF2)

イロコイホメオボックス 3

KiSS-1 転移抑制因子

長く点在する核元素-1

メイスホメオボックス 1

モチーフを引き出すための複数のEM

ナノグホメオボックス

Nanos C2HC型ジンクフィンガー3

8-オキソグアニン DNA グリコシラーゼ

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ

PR/SET ドメイン 6

サテライトアルファ

Sp1転写因子

Sp2転写因子

SUV39H1 ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ

SUV39H2 ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ

Tボックス転写因子2

TEAドメイン転写因子4

テロメアリピートを含むRNA

テロメラーゼ逆転写酵素

甲状腺ホルモン受容体α

腫瘍壊死因子

血管内皮増殖因子A

血管内皮ジンクフィンガー 1

X 不活性な特異的転写物

ジンクフィンガープロテインY結合型

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配列決定は、「France Genomique」コンソーシアム (ANR-10-INBS-0009) のメンバーである GenomEast プラットフォームによって実行されました。 PELAGIE 研究に参加していただいた助産師、産婦人科医、超音波検査技師、小児科医、心理学者、そしてご家族の皆様に感謝いたします。

この研究は、フランス財団からセシル・シェブリエとジョアンナ・ルプルへの資金提供によって支援されました。 Chunxiang HAO は、中国国立自然科学財団 (31801061) の支援を受けました。著者らは、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム HBM4EU の SCD および MC の財政支援に感謝します。

次の著者も同様に貢献しました: Martina Capriati、Chunxiang Hao、Shereen Cynthia D'Cruz。

大学 Rennes、EHESP、Inserm、Irset (健康、環境、労働研究所) - UMR_S 1085、35000、レンヌ、フランス

マルチナ・カプリアティ、シェリーン・シンシア・ドゥクルーズ、クリスティーヌ・モンフォール、セシル・シェブリエ、シャルリーヌ・ワーレンブール、ファティマ・スマグロワ

臨沂大学医学部、臨沂、276000、中国

ハオ・チュンシアン

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FS と CC が研究を設計しました。 SCD および FS はゲノム DNA を抽出しました。 MC、FS、SCD は ChIP 実験を実施しました。 MCはWB解析を行った。 MC と FS は ChIP-seq ライブラリを生成しました。 CH は配列データを分析しました。 FS は、マウス胎盤形態学、免疫蛍光分析、および RT-qPCR 分析を実行しました。 CW はデータの統計分析を実行しました。 MC、FS、SCD、CCが原稿を書きました。 CW、CH、MCは数字を用意しました。著者全員が原稿をレビューしました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ファティマ・スマグロワ氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Capriati、M.、Hao、C.、D'Cruz、SC 他。有機リン酸代謝物に曝露された母子PELAGIEコホートにおける性特異的差異のゲノムワイド分析。 Sci Rep 13、8003 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35113-8

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受信日: 2022 年 10 月 6 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35113-8

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