オングストローム

Nature volume 617、pages 711–716 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

蛍光顕微鏡は、その分子特異性により、複雑な生物学的システムを理解するために生命科学で使用される主要な特性評価方法の 1 つです。 超解像アプローチ 1、2、3、4、5、6 では、細胞内で 15 ～ 20 nm の範囲の解像度を達成できますが、個々の生体分子間の相互作用は 10 nm 以下の長さスケールで発生し、分子内構造の特性評価にはオングストロームの解像度が必要です。 最先端の超解像度実装 7、8、9、10、11、12、13、14 は、特定の in vitro 条件下で 5 nm までの空間解像度と 1 nm の位置特定精度を実証しました。 ただし、そのような分解能は細胞内での実験に直接変換されるわけではなく、オングストローム分解能は現在まで実証されていません。 ここでは、市販の蛍光顕微鏡ハードウェアと試薬を使用して蛍光顕微鏡の解像度をオングストロームスケールまで向上させる、DNA バーコーディング法である逐次イメージングによる解像度向上 (RESI) を導入します。 まばらな標的サブセットを15 nm以上の中程度の空間分解能で連続的にイメージングすることにより、無傷の細胞全体の生体分子について単一タンパク質の分解能が達成できることを実証します。 さらに、DNA オリガミの単一塩基の DNA 骨格距離をオングストロームの分解能で実験的に解決します。 我々は、この方法を原理実証の実証に使用して、未処理および薬物処理細胞における免疫療法の標的CD20の分子配置をin situでマッピングします。これにより、標的免疫療法の分子機構を評価する可能性が開かれます。 これらの観察は、RESI が無傷の細胞全体の周囲条件下で分子内イメージングを可能にすることにより、超解像顕微鏡と構造生物学研究の間のギャップを埋め、複雑な生物学的システムを理解するための鍵となる情報を提供することを示しています。

広視野単一分子局在顕微鏡法 (SMLM)15 における標的分子の局在精度 (σSMLM) は、最終的かつ根本的に、点滅イベントごとに収集される光子 (N) の数によって制限されます。 \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\estimate \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF は光学素子の点像分布関数 (PSF) の SD です。画像化システム１６、図１ａ）。 同じターゲットの複数の位置特定 (図 1b、上) は、精度が有限であるため、真の位置の周囲に分散されます。 SMLM で解決できない 2 つ以上の点は、位置の重複分布を生成するため、それぞれのターゲットに位置を一意に割り当てることができなくなります (図 1b、下)。 ただし、色、バーコード、またはその他の分子のアイデンティティによって各局在化を特定のターゲットに割り当てることができれば、それらをターゲットごとに明確にグループ化できる可能性があります2。

a、SMLM では、単一色素の σSMLM が \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) に応じて変化し、最終的には達成可能な空間解像度が制限されます。 b、DNA-PAINT などの SMLM アプローチは、約 10 nm の空間分解能を特徴とします (分解能は半値全幅 ≈ 2.35 σSMLM として概算されます)。 したがって、20 nm 離れたターゲット (d1) は通常どおり解像できますが、2 nm 離れたオブジェクト (d2) は、結果として生じる位置分布の分布が重なるため解像できません。 c. Exchange-PAINT と同様に、直交 DNA 配列 (青と緑) と逐次取得を使用して、SMLM 解像度限界よりも近い間隔にあるターゲットからの位置を各ターゲットに明確に割り当てることができます。 d、各イメージングラウンドのターゲット（K）ごとのすべての位置特定を組み合わせると、位置特定精度がsd（σSMLM）からsem（σRESI）に向上します。 e. 超解像が蛍光顕微鏡法に革命をもたらしたため、RESI は局在化の概念を超解像データに再適用することにより、別のパラダイム シフトをもたらしました。 f、RESI での位置特定精度は \(\frac{1}{\sqrt{K}}\) でスケールされるため、RESI での解像度の向上は σSMLM とは独立しており、オングストローム スケールでの位置特定精度に達します。

局在化の各グループの中心は、σSMLM よりもはるかに優れた精度で計算できます。 本質的に、局在化顕微鏡の原理を K 個の超解像局在化の識別可能なグループに適用すると、精度は sd (σSMLM) から sem (\(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}) まで向上します。 }}{\sqrt{K}}\))。 任意の多数のローカリゼーションを収集すると、任意の精度が向上します。 注目すべきことに、この精度の向上は、個々の位置特定で達成される精度 (σSMLM) に関係なく発生します。

DNA-PAINT18のバリアントであるExchange-PAINT17を使用して、同一の標的分子に対してこの概念を直接実装する方法を紹介します（図1c）。 DNA-PAINT は、色素標識された「イメージャー」鎖と、目的の標的分子上の相補的な「ドッキング」鎖との、プログラム可能な反復的かつ一時的な結合を使用します9,18。 結合の一時的な性質により、SMLM を実行するために必要なターゲットの明らかな「点滅」が生じます。 Exchange-PAINT は、直交 DNA バーコードをイメージングおよび洗浄サイクルと組み合わせて使用​​し、連続的なターゲットの多重化を可能にします。 私たちの実装では、単一のターゲット種を複数のまばらなサブセットに分離することで「多重化」します。 それらを連続的に画像化することにより、十分な間隔を置いて分離された局在化グループが測定されます。 ローカリゼーションの各グループの中心を決定すると、解像度が向上します (図 1d)。 この実装を逐次イメージングによる解像度向上 (RESI) と呼び、その結果生じる位置特定を RESI 位置特定と呼びます。

RESI in silico（方法）の適用により、回折限界測定に対する超解像の改善（図1e）と同様の、超解像に対する解像度の向上（拡張データ図1）を実証しました。 日常的に入手可能な DNA-PAINT の位置特定精度 (約 3 nm) とターゲットあたりの位置特定の数 (数百のオーダー) の場合、RESI は 1 ナノメートルをはるかに下回る精度を達成でき、したがって \( {\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\)。

RESI の原理を実験的に証明するために、我々は自己組織化 DNA 折り紙構造を使用して、直交する DNA 鎖を正確に配置しました 9,19。 私たちは最初に、RESI の精度と精度を検証するために、DNA-PAINT7,9 で以前に解決された距離である 5 nm の間隔を置いた 2 つのドッキング鎖を特徴とする DNA 折り紙を設計しました。 RESI を実行するための 2 つの連続イメージング ラウンドとアライメント手順 (方法) を使用して、\(\sqrt{{K}_{{\ の係数で向上した精度で 5 nm のポイントツーポイント距離を正確に再現することができました) rm{平均}}}}=\sqrt{381}\約 20\) (拡張データ図 2 および 3)。

次に、最近開発された 3D DNA 折り紙ディスク構造 20 を使用して 3 次元 (3D) で RESI を実行し、ドッキング鎖間の距離を xy で 2.5 ± 0.4 nm、z で 11.3 ± 0.8 nm と測定しました。 これは、RESI 解像度の向上が 3 次元すべてに適用され、現在の最先端の 3D 超解像度機能を上回っていることを示しています (拡張データ図 4 および 5。イメージング パラメータについては拡張データ表 1 を参照)。

細胞の状況における RESI の適用可能性を実証するために、次に核膜孔複合体 (NPC) の構造タンパク質を画像化しました。 核細胞質輸送の主要な門番である NPC は、構造生物学研究の重要な標的です 21。 さらに、NPC をモデルシステムとして選択したのは、NPC がクライオ電子顕微鏡 (クライオ EM)22、蛍光顕微鏡、超解像技術 23,24 などのさまざまなイメージング手法を使用してよく研究されているためです。 図 2a は、DNA 結合抗 GFP ナノボディで標識された Nup96 分子 (単量体増強緑色蛍光タンパク質 (mEGFP) でタグ付け) の典型的な回折限界および DNA-PAINT 画像を示しています。 Nup96は、細胞質環と核環の両方で8回の対称性を示す8対で存在する構造NPCタンパク質（いわゆるY複合体の一部）であり、NPCあたり合計32コピーです（図2b）。 横方向に約 10 nm、軸方向に約 3 nm の間隔で配置された Nup96 タンパク質の個々のペアは、現在の最先端の超解像実装では日常的に分解することはできません 25、26、27、28。 RESI を有効にするには、Nup96 タンパク質の隣接するコピーを直交 DNA 配列で標識する必要があります。 この目的を達成するために、我々は、それぞれが4つの直交配列のうちの1つと結合した抗GFPナノボディとサンプルをインキュベートすることによる確率的標識アプローチを選択しました（図2c）。 従来の DNA-PAINT 解像度限界を下回る予想されるターゲットの数が増加しているため、十分な間隔の位置グループを保証するには、より多くの直交標識シーケンス 29、つまりイメージング ラウンドが必要であることに注意してください (この要件の詳細については、「方法」を参照してください)。 ）。 4ラウンドの連続3D画像取得により、単一のNup96標的分子を表す十分に間隔をあけた局在化グループが得られました（図2d）。 これらのグループのその後のRESI超局在化により、Nup96タンパク質の個々のコピーを日常的に視覚化することができました（図2e）。 これは、合計 100 分の画像取得時間中に合計 1,000 NPC を超える全視野 (約 67 × 67 µm2) にわたって達成されたことに注目します (代表的なデータについては拡張データ図 6 を参照)。 再構成された RESI 画像は、平均横方向位置特定精度が約 1 nm であり、個々の DNA-PAINT 取得ラウンドと比較して 6 倍の向上を示しています。 したがって、ラベルサイズに制限された解像度を達成し、個々のNup96分子を分離できるようになりました（図2f）。 一般に、ラベル サイズは空間解像度を制限するだけでなく、リンケージ エラーにより観測距離の偏りなどの不正確さを引き起こす可能性があります。

a、DNA結合抗GFPナノボディで標識されたNup96-mEGFPの回折限界およびDNA-PAINT概要画像。 拡大表示 (右下) は、標準的な DNA-PAINT 条件での高い標識効率と画質を示し、NPC の 8 回対称性を再現しています。 b、核および細胞質リング（それぞれNRおよびCR）内のY複合体の一部としてのNup96タンパク質の位置（赤色、C末端mEGFP位置を青色でマーク）のCryo-EM構造図。 PDB 7PEQ から適応。 Nup96 は NPC ごとに 32 コピー存在します。 c、RESIを有効にするために、Nup96-mEGFPタンパク質は、サンプルを抗GFPナノボディとインキュベートすることによって直交DNA配列で確率的に標識され、それぞれが4つの直交配列（青、黄、マゼンタ、緑の点で表される）の1つと結合しました。 d. 4 つのラベルの連続 3D イメージング (色は Z 位置を表す) により、十分な間隔の局在化分布が得られました。 ターゲットごとの局在化の平均数は Kaverage = 38 です (背景はコンテキストのために b からのクライオ EM 構造を表します)。 e、同じ NPC の 3D DNA-PAINT (左上) と 3D RESI (右下) の比較。RESI による空間解像度の向上を示しています。 局在化は、それぞれ σDNA-PAINT と σRESI を使用してガウスとしてレンダリングされます。 f、各ターゲットの K 局在化を組み合わせ、単一の Nup96 タンパク質を明確に分離することにより、5 Å もの局在化精度 (σRESI) が達成されました。 g. 3D NPC クライオ EM 構造は、単一核からの 1,217 NPC のモデルフリー平均 30 を適用することにより、光学顕微鏡を使用して再現されました。 h、RESI は光学顕微鏡により構造平均で隣接する Nup96 を分解しました。 i. クライオ EM 構造と一致して (標識サイズから生じる結合誤差を考慮して)、隣接する Nup96 タンパク質は横方向 (上) に 11.9 ± 1.2 nm、軸方向 (下) に 5.4 ± 0.4 nm の間隔がありました。

次に、SMLM データ用に最近開発されたモデルフリーのアプローチを使用して、1,217 人の NPC の不偏 3D 平均化を実行しました 30。 得られた3D平均（図2g）により、細胞質リングと核リングの両方におけるNup96の8回対称性（これは以前に超解像度で達成されていました23、24、25、26、27、28）を再現できるだけでなく、構造平均における個々の Nup96 タンパク質の分解が可能になります (図 2h)。 RESIの前例のない空間分解能により、構造平均画像から横方向に11.9±1.2nm、軸方向に5.4±0.4nmのNup96タンパク質の距離を再現することができました（図2i）。 Nup96 ペアの横方向および軸方向の両方の配向、および傾きは、クライオ EM データと一致しています 22。 私たちは、これまで光学顕微鏡では不可能であった、ほとんどの Nup96 タンパク質ペアのこの空間配置を解決しました (拡張データ図 7)。

RESI によって最終的に達成可能な空間分解能を評価するために、わずか 1 つの DNA 塩基対の距離にある直接隣接する直交ドッキング鎖の 6 対 (20 nm の間隔) を特徴とする平坦な長方形の DNA 折り紙構造を設計しました (図の赤と青の鎖) .3a)。 これにより、DNA 二重らせんの 1 つの鎖の主鎖に沿った約 7 Å の設計された面内距離が得られました 31。 この構造には、連続するイメージングラウンド間の正確な位置合わせのための DNA-PAINT ドッキング鎖も含まれています (図 3a の緑色の鎖)。 約5 nmの空間分解能での最先端のDNA-PAINT画像取得32では、20 nmのグリッド配置で6つの局在化雲が得られましたが、サブナノメートルの単一塩基対の距離で個々のドッキング鎖を分解することはできませんでした（図3b）。

a、単一塩基対の間隔でドッキング鎖をもつ DNA オリガミ (bp; 赤と青の鎖、緑のアライメント マーカー付き) は、RESI によって達成可能な最高の分解能を実証するためのプラットフォームを提供しました。 b、DNA-PAINT は 20 nm の間隔を分解しましたが、その分解能は 1 塩基間隔の個々のドッキング サイトを区別するには不十分でした。 c、RESI は隣接するドッキング ストランドを解決します。 d、8.5 ± 1.7 Å のユークリッド距離は、単一塩基対バックボーン距離の平均精度 1.2 Å (左) で個々の局在化から計算されました。これは、期待値約 7 Å (右) の 1 sd 以内です。 ）。 e、RESI での実験的な位置特定精度は \(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\) (青線、K) と良く一致しており、すべての n = 42 DNA 折り紙からの実験データの平均位置特定精度は 1.3 Å (挿入図は d の例示​​的な点ペアに対応します)。 エラーバーは平均±1 sdを表す

注目すべきことに、RESIはすべてのDNA折り紙構造における個々のドッキング鎖の位置を解決します（図3c）。 RESI は、2,000 以上の DNA 折り紙構造を含む約 67 × 67 μm2 の視野を特徴とする 100 分の画像取得時間でこれを達成したことに注目します (代表的な DNA 折り紙構造については拡張データ図 8 を参照)。 RESI を使用すると、1 つの DNA 塩基対だけ離れた鎖を日常的に解決できます。 驚くべきことに、個々の DNA 折り紙構造における 2 本の単一ドッキング鎖間の距離は 8.5 ± 1.7 Å でした (図 3d)。 これは、1 ナノメートルよりも近い構造を区別することにより、光学顕微鏡で前例のない分解能を実証します。 私たちの解像度の主張は、点オブジェクトを空間的に区別する能力という最も基本的かつ厳密な定義に基づいていることに注意してください。 平均 42 個の DNA 折り紙で隣接するドッキング鎖間の距離は 9.5 ± 2.6 Å でした (拡張データ図 9)。これは、約 7 Å の予想されるバックボーン距離 31 の 1 sd 以内です。

解像度の向上を定量化するために、基礎となる DNA-PAINT 局在化の K のさまざまな値に対する RESI 局在化を計算しました (方法)。 有効な位置特定精度は \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}] のようにスケールされることを示します。 }\）、平均 K = 254 で 1.3 Å の平均位置特定精度が得られ（図 3e）、インシリコの結果を実験的に確認しました（図 1f）。 RESI は、ターゲットごとに事実上無制限の数の局在化を実現するだけでなく、DNA-PAINT イメージングでは 2 つの隣接する色素が同時に存在することがないため、固定色素ラベルの空間的近接によって引き起こされる有害な光物理効果を回避します。 最近、10 nm 未満の距離では、光物理的近接場相互作用が光スイッチング反応速度の変調に主要な役割を果たし、固定色素 SMLM 技術がこの解像度スケールにアクセスするのを効果的に妨げていることが報告されています。 これにより、MINFLUX や MINSTED など、単一分子の位置特定に利用できる最も光子効率の高い技術であっても、ナノメートル未満の精度にもかかわらず、DNA-PAINT と組み合わせない限り、達成可能な解像度が最終的に制限されます。 実験的に実証されたサブナノメートルの分解能は、これまで実現できなかったスケールでの DNA ベースのイメージングを使用した構造生物学研究を可能にする RESI の能力を示しています。

最後に、我々は RESI を適用して、現在議論されている細胞生物学的な問題に取り組み、解決しました。この問題は、ネイティブな細胞状況におけるクライオ EM と既存の超解像技術の両方ではこれまでのところ手の届かないものでした。 具体的には、B 細胞由来の血液がんや自己免疫疾患の抗体治療の主要な標的である CD20 膜受容体の構成を研究しました 34。

最も頻繁に使用される治療用抗 CD20 抗体であるリツキシマブ (RTX) の場合、細胞膜内の CD20 の空間的再構成がその有効性に重要な役割を果たしていると考えられています 35,36。 最近のクライオ EM 研究では、CD20 が 2 つの個別の RTX フラグメント抗原結合領域と複合した二量体として検出され 37,38 、完全抗体の存在下で CD20 が直鎖状に集合していることが示唆されました 38。 一方、完全 RTX 抗体とインキュベートすると、RTX 分子と CD20 二量体が交互に並ぶ三量体リングが EM 画像で検出されました 37。 クライオ EM 実験が界面活性剤溶液中で行われるという事実から、実際に細胞内にどのような分子配置が存在するのかという疑問が生じます。 現在、無傷の細胞内で完全な RTX 抗体に結合した場合の CD20 の組織化を評価することはできないため、CD20 クラスターが線状であるか環状であるかの調査ができません。 さらに、in vitro 研究では抗体結合なしでも CD20 二量体が形成できることが示されていますが、未処理細胞における CD20 二量体化の定量的評価は現時点では限られています。

ここでは、RESI を適用して、総イメージング時間 4.4 時間で 4 ラウンドのプローブ交換を使用して、mEGFP-CD20 を一過的にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞における CD20 の分子配置を研究しました。 未処理細胞の回折限界の概要と DNA-PAINT 超解像度画像では、CD20 は均一に分布しているように見えましたが (図 4a、b (上) および拡張データ図 10a)、RTX 処理細胞は明らかな CD20 クラスターを示しました (図 10a)。 4b (下) および拡張データ図 11a および 12a)。

a、抗GFPナノボディで標識されたmEGFP-CD20を発現するCHO細胞の回折限界およびDNA-PAINT概要画像。 b、未処理細胞（上）では明らかにランダムに分布したCD20受容体、RTX処理細胞（下）ではクラスター化された受容体配置を示す拡大DNA-PAINT画像。 c、未処理細胞とRTX処理細胞の両方についてのDNA-PAINTとRESIの比較。RESI画像内に10nm未満の間隔の受容体ペアが示されていますが、これはDNA-PAINTでは解決できません。 d、RESIデータは、CD20タンパク質が二量体（ddimerの間隔）で存在し、未処理細胞では完全な空間ランダム性（CSR;二量体間の距離、dCSR）に従って分布していることを示唆しています。 RTX の投与後に二量体の鎖が観察されました。 e、CD20受容体の最初のNNDの全細胞解析（距離のヒストグラムとカーネル密度推定が示されている）。 タンパク質間の 10 nm 未満の距離を日常的に検出できるのは、DNA-PAINT ではなく RESI だけです。 DNA-PAINT は二量体の距離を過大評価しますが、RESI は 13.5 nm の標識限界距離を示します (議論については本文を参照)。 f、eからのRESI NNDデータを数値モデルに当てはめると、CD20の二量体と単量体が明らかになります。 g、未処理細胞の CD20 受容体は、CSR と一致する 2 番目から 4 番目の NND を示し、したがって高次のタンパク質複合体の存在が除外されました。 h、しかし、RTX 処理細胞の CD20 受容体は、完全な空間的ランダム性と一致しない、1 番目から 4 番目の NND を示しました。

未処理細胞と RTX 処理細胞の両方について DNA-PAINT と RESI を比較すると、DNA-PAINT (図 4c、左) では解決できなかった RESI 画像 (図 4c、右) の 10 nm 未満の間隔の CD20 ペアが示されています。 。 RESI画像は、未処理細胞とRTX処理細胞ではそれぞれCD20が二量体と鎖状の高次構造で存在することを示唆しています（図4d）。

未処理の細胞における二量体の存在を定量的に評価するために、DNA-PAINTデータとRESIデータの両方に対して最初の最近傍距離（NND）分析を実行し、両方のケースで非ランダムな分布を示しました（図4e）。 1 nm の位置特定精度での RESI は、NND ヒストグラム内の 10 nm 未満の距離のかなりの部分を示し、これにより CD20 二量体化の程度の定量的評価が可能になります。 数値シミュレーションと最小二乗フィット（方法）を実行したところ、平均二量体内距離13.5±0.3 nmの53±1％の単量体と47±1％の二量体の組成が得られました（図4f、実線）。 比較のために、100％モノマーの集団に対応するNND分布をシミュレートしました（図4f、点線）。これは、CD20分子がモノマーとしてのみ存在しないことをさらに示しています。 一次を除くすべてのNND分布は、実験的に測定された密度での完全な空間ランダム（CSR）分布と一致しているため、未処理のCD20の高次アセンブリの存在を除外します（図4g）。 我々の発見は、CD20が無傷の細胞膜内に二量体として存在するという定量的な実験的証拠を示している。

対照的に、RTX処理細胞におけるCD20のRESI分析では、CSRモデルと一致しない第1から第4のNND分布が得られました（図4hおよび拡張データ図12d、e）。 これは、RTX 処理後の CD20 分子の高次配列を示唆しており、最近のクライオ EM 由来モデルを裏付けています 37,38。

最後に、数値シミュレーションとの比較により、六量体のリング状配置の存在を調査しました (拡張データ図 13)。 実験的に検出されたCD20クラスターの特徴は、孤立した六量体が存在しないことを示唆しており、主に線状の鎖状構造であるという仮説を裏付けています（拡張データ図13h）。

光学顕微鏡の空間分解能をオングストロームスケールまで向上させる、SMLM における概念的に新しいアプローチである RESI を紹介します。 RESIは、連続イメージング（たとえば、DNAバーコードプローブを使用）によってそれらの局在を分離した後、単一のターゲットからの複数の局在を組み合わせて「超超解像度」画像を取得することでこれを実現します。

このようにして、RESI の精度、つまり解像度は、位置特定ごとに検出される光子の数 (N) だけでなく、ターゲットごとに取得される位置特定の数 (K) にも応じて調整されます。 したがって、RESI は新しい精度スケーリング則を提供します: \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K} }\約 \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{K}\sqrt{N}}\)。 これは、十分な数の直交ラベル付けシーケンス、したがって画像化ラウンドが適切な間隔で配置された位置特定グループを保証する場合に適用されます (拡張データ図 14)。 重要なのは、解像度の向上は 3 次元で等方性であるということです。 現在の実験実施では、RESI は、既製の標識試薬と周囲条件下で動作する単純な倒立蛍光顕微鏡を使用して、無傷の細胞における全光学的アプローチで構造生物学の解決に取り組んでいます。 私たちは、色素の物理的サイズを下回るオングストロームの空間分解能を実験的に実証することができました。 これは、偏りのないターゲットサンプリングをもたらす DNA-PAINT の 3 つの特有の利点によって達成されました。(1) ターゲットに結合したドッキング鎖の回転の柔軟性 (より長い反復配列モチーフの場合でも 32)。 (2) イメージャシーケンスに取り付けられた色素の自由に回転する双極子。 (3) 2 つの隣接するイメージャが同時に存在することは決してないという事実。

さらに、RESI 画像は単一の位置特定からではなく、ターゲットごとの位置特定のグループから取得されるため、この方法は他の SMLM 技術と比較して独自の堅牢な特徴を示します。光学精度 (σOPT) のみの向上から全体的な精度の向上に焦点を移します。 (\({\sigma }_{{\rm{SMLM}}}\about \sqrt{{{\sigma }_{{\rm{OPT}}}}^{2}+{{\sigma }_{ {\rm{MEC}}}}^{2}}\)) は、機械的不安定性 (σMEC) が正規分布している場合に、その不確実性の影響を平均化します。

RESI を使用すると、67 × 67 μm2 の領域を 100 分で測定でき、細胞生物学に十分なハイスループットのツールとして適用できるようになりました。 単一タンパク質の解像度で受容体パターンを解決できれば、個別化された治療法のための事前スクリーニング方法として「空間診断」が可能になり、たとえば医薬品設計原則の指針となるなど、パターン化された治療法の生物医学的発見のためのツールとして機能する可能性がある。

RESI の性能と精度は、直交非天然アミノ酸などの分子内標識アプローチの進歩によってさらに改善される可能性があります 39。 したがって、RESI は、完全な細胞全体の 3D 蛍光超解像度顕微鏡と個々の超分子複合体のクライオ EM 構造研究との間のギャップを埋める準備ができており、光学顕微鏡をオングストロームの解像度に押し上げることによって、蛍光イメージングにパラダイムシフトを導入します。

未修飾の DNA オリゴヌクレオチド、および C3-アジドおよび Cy3B で修飾された DNA オリゴヌクレオチドは、MWG Eurofins および Metabion から購入しました。 M13mp18 および p7560 足場は Tilibit から入手しました。 塩化マグネシウム (1 M、番号 AM9530G)、塩化ナトリウム (5 M、番号 AM9759)、超純水 (番号 10977-035)、トリス (1 M、pH 8.0、番号 AM9855G)、EDTA (0.5 M、 pH 8.0、番号 AM9260G) および 10× PBS (番号 70011051) は Thermo Fisher Scientific から購入しました。 BSA (番号 A4503-10G) は Sigma-Aldrich に注文されました。 Triton X-100 (番号 6683.1) は Carl Roth から購入しました。 水酸化ナトリウム (番号 31627.290) は VWR から購入しました。 パラホルムアルデヒド (番号 15710) およびグルタルアルデヒド (番号 16220) は、Electron Microscopy Sciences から入手しました。 Tween-20 (番号 P9416-50ML)、グリセロール (番号 65516-500 ml)、メタノール (番号 32213-2.5L)、プロトカテク酸 3,4-ジオキシゲナーゼ シュードモナス (PCD、番号 P8279)、3,4-ジヒドロキシ安息香酸 (PCA、番号 37580-25G-F) および (±)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸 (トロロックス、番号 238813-5G) を注文しました。シグマアルドリッチ。 ニュートラアビジン (番号 31000) は Thermo Fisher Scientific から購入しました。 ビオチン標識 BSA (番号 A8549) およびアジ化ナトリウム (番号 769320) は Sigma-Aldrich から入手しました。 カバースリップ (番号 0107032) およびスライドガラス (番号 10756991) は、それぞれ Marienfeld および Thermo Fisher Scientific から購入しました。 ウシ胎児血清 (FBS、番号 10500-064)、1× PBS (pH 7.2、番号 20012-019)、0.05% トリプシン-EDTA (番号 25300-054)、サケ精子 DNA (番号 15632011)、OptiMEM (番号 31985062) およびリポフェクタミン LTX (番号 A12621) は Thermo Fisher Scientific から購入しました。 金ナノ粒子 (90 nm、番号 G-90-100) を Cytodiagnostics に注文しました。 部位特異的結合のためにC末端に単一の異所性システインを有するGFPに対するナノボディ(クローン1H1)は、Nanotag Biotechnologiesから購入した。 DBCO-PEG4-マレイミド (番号 CLK-A108P) は Jena Bioscience から購入しました。

サンプルの調製とイメージングには次のバッファーを使用しました。

緩衝液 A: 10 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、および 0.05% Tween-20

緩衝液 B: 10 mM MgCl2、5 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA および 0.05% Tween-20 pH 8.0

緩衝液C: 1× PBS、1 mM EDTA、500 mM NaCl pH 7.4、0.02% Tween、必要に応じて1× trolox、1× PCAおよび1× PCDを添加

ブロッキングバッファー: 1× PBS、1 mM EDTA、0.02% Tween-20、0.05% NaN3、2% BSA、0.05 mg ml-1 切断サケ精子 DNA

二次元 (2D) DNA オリガミ フォールディング バッファー: 10 mM Tris、1 mM EDTA、12.5 mM MgCl2 pH 8.0

3D DNA origami フォールディングバッファー: 5 mM Tris、1 mM EDTA、5 mM NaCl、20 mM MgCl2 pH 8.0

1× TA バッファー: 40 mM トリス pH 8.0、20 mM 酢酸

トロロックス（１００×）は、３．２ｍｌの水中の４３０μｌの１００％メタノールおよび３４５μｌの１Ｍ ＮａＯＨに１００ｍｇのトロロックスを添加することによって作製した。 ＰＣＡ（４０×）は、１５４ｍｇのＰＣＡを１０ｍｌの水およびＮａＯＨに混合し、ｐＨを９．０に調整することによって作製した。 PCD (100×)は、9.3 mgのPCDを13.3 mlの緩衝液(100 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM KCl、1 mM EDTA、50% グリセロール)に添加することによって作製した。

4 つの直交する DNA 配列モチーフを使用して、4 回の RESI ラウンドでターゲットを標識しました。 ドッキング鎖は、5xR1 (TCCTCCTCCCTCCTCCTCCT)、5xR2 (ACCACCACCACCACCACCACCA)、7xR3 (CTCTCTCTCTCTCTCTCTC)、および 7xR4 (ACACACACACACACACACA) でした。 それぞれのイメージャは、R1 (AGGAGGA-Cy3B)、R2 (TGGTGGT-Cy3B)、R3 (GAGAGAG-Cy3B)、および R4 (TGTGTGT-Cy3B) でした。 2D RESI 折り紙の設計では、隣接する R1 および R3 ドッキング鎖が単一塩基対だけ離れて配置できるように、5' 末端の R1 部位を延長する必要がありました。 したがって、両方の 2D DNA 折り紙の 3' バージョンではなく、ドッキング鎖 5' 5xR1 (TCCTCCTCCTCCTCCTCCT) および 5' R1 イメージャー (Cy3B-AGGAGGA) が使用されました。

すべての 2D DNA 折り紙構造は caDNAno40 で設計されました。 DNA オリガミの自己集合は、10 nM 足場鎖 (配列については補足データ 2 を参照)、100 nM フォールディング ステープル (補足データ 1)、500 2D DNA 折り紙フォールディングバッファー中の nM ビオチン化ステープル (補足データ 1) およびドッキング部位拡張を持つ 1 μM ステープル鎖 (補足データ 1)。 次いで、反応混合物を、サーモサイクラーを使用して熱アニーリングランプにかけた。 まず、80 °C で 5 分間インキュベートし、60 °C から 4 °C まで 3.21 分ごとに 1 °C ずつの温度勾配を使用して冷却し、最後に 4 °C に保持しました。

3D DNA 折り紙ディスク構造は caDNAno40 で設計されました。 DNA オリガミディスクの自己集合は、20 nM 足場鎖 p7560 (配列については補足データ 3 を参照)、200 nM コアフォールディングステープル (補足データ 1) で構成される総容量 50 μl のワンポット反応ミックスで達成されました。 、ハンドル拡張のない 200 nM ステープル配列 (補足データ 1)、500 nM ビオチン化ステープル (補足データ 1)、R4 ドッキング サイト拡張を含む 2 μM ステープル鎖および R1 または R3 ドッキング サイト拡張を含む 4 μM ステープル鎖 (補足データ 1) 3D DNA 折り紙フォールディングバッファー内。 次いで、反応混合物を、サーモサイクラーを使用して熱アニーリングランプにかけた。 最初に 80 °C で 5 分間インキュベートし、次に 60 °C から 20 °C まで 1 °C h–1 のステップで温度勾配を使用して冷却し、最後に 20 °C に保持しました。

自己集合後、4.5 V cm-1 で 1.5 時間、アガロースゲル電気泳動 (1.5% アガロース、1 × TA、10 mM MgCl2、0.5 × SybrSafe) によって構造を精製しました。 ゲルバンドを切断、粉砕し、折り紙を低結合エッペンドルフチューブに-20℃で保存した。

サンプル調製のために、底なし 6 チャンネル スライド (ibidi、番号 80608) をカバースリップに取り付けました。 まず、80 μl のビオチン標識 BSA (1 mg ml-1、バッファー A に溶解) をチャンバーに流し込み、5 分間インキュベートしました。 次に、チャンバーを 360 μl のバッファー A で洗浄しました。次に、100 μl のニュートラアビジン (0.1 mg ml-1、バッファー A に溶解) をチャンバーに流し込み、5 分間結合させました。 180μlの緩衝液Aで洗浄し、続いて360μlの緩衝液Bで洗浄した後、緩衝液B中の80μlのビオチン標識DNA構造(約200pM)をチャンバーに流し込み、5分間インキュベートした。 DNA オリガミ ディスクの測定では、20 nm 間隔で 12 個のターゲット サイト9 を配置した追加の 2D DNA オリガミ構造を一緒にインキュベートし、3D ディスク オリガミをドリフト補正の基準として機能させました。 DNA オリガミのインキュベーション後、チャンバーを 540 μl のバッファー B で洗浄しました。DNA オリガミ ディスク構造の場合、150 μl の金ナノ粒子 (バッファー B で 1:10 に希釈) を流し、5 分間インキュベートした後、540 μl のバッファーで洗浄しました。 B. 最後に、バッファー B 中のイメージャー溶液 180 μl をチャンバーに流し込みました。 チャンバーはイメージャー溶液で満たされたままであり、イメージングが実行されました。 イメージングラウンドの間に、前のイメージャー溶液からの残留シグナルが検出されなくなるまで、サンプルを 1 ml のバッファー B で 3 回洗浄しました。 そこで次のイメージャーソリューションが導入されました。 RESI の場合、ラウンド 1 に存在するイメージャ R1 と R4、ラウンド 2 に存在するイメージャ R3 と R4 を使用して 2 つのイメージング ラウンドが実行されました (R1 と R3 は RESI の対象部位をプローブし、R4 は位置合わせの目的に役立ちます)。

ナノボディは、以前に記載されているように結合されました32。 結合していないナノボディを氷上で解凍し、その後、20倍モル過剰の二官能性DBCO-PEG4-マレイミドリンカーを添加し、氷上で2時間反応させた。 未反応のリンカーは、Amicon遠心フィルター(10,000 MWCO)を使用してPBSへの緩衝液交換によって除去した。 DBCO 修飾ナノボディを、5 倍モル過剰のアジド官能化 DNA (R1、R2、R3 および R4) と 4 °C で一晩反応させました。 Resource Q 1 ml カラムを備えた ÄKTA pure system を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーによって、結合していないタンパク質と遊離 DNA を除去しました。

CHO細胞（CCL-61、ATCC）を、10％FBS（番号11573397、Gibco）を補充したGibco Ham's F-12K（Kaighn's）培地中で培養した。 U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP細胞(Ries and Ellenberg研究所から寄贈)を、10% FBSを添加したMcCoy's 5A培地(Thermo Fisher Scientific、no.16600082)で培養した。 トリプシン-EDTAを使用して細胞を2〜3日ごとに継代しました。

U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP 細胞を、ibidi 8 ウェル高ガラス底チャンバー (番号 80807) に 30,000 cm-2 の密度で播種しました。 細胞を、室温で３０分間、ＰＢＳ中の２．４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。 固定後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。 金ナノ粒子(200μl)を5分間インキュベートし、PBSで3回洗浄した。 ブロッキングおよび透過処理は、ブロッキング緩衝液中の0.25% Triton X-100を用いて90分間実施した。 PBSで洗浄した後、細胞をブロッキング緩衝液中の100nM抗GFPナノボディとともに室温で60分間インキュベートした。 RESIを可能にするために、ナノボディ溶液は、総ナノボディ濃度100 nMの25 nM R1、R2、R3、およびR4ドッキング鎖結合抗GFPナノボディから構成されました。 未結合のナノボディは、ＰＢＳで３回洗浄し、続いて緩衝液Ｃで１０分間１回洗浄することによって除去した。 後固定は、PBS中の2.4%パラホルムアルデヒドを用いて15分間実施した。 ＰＢＳで３回洗浄した後、緩衝液Ｃ中のイメージャー溶液をチャンバーに流し込んだ。 イメージングラウンドの間に、前のイメージャー溶液からの残留信号が検出されなくなるまで、サンプルを 1 ～ 2 ml の PBS で洗浄しました。 そこで次のイメージャーソリューションが導入されました。 まず、イメージャ R1、R2、R3、および R4 をサンプルに同時に追加して、標準的な DNA-PAINT 測定を実行しました。 次に、イメージャの 1 つだけを使用して、その後 4 回のイメージング ラウンドを介して RESI イメージングを実行しました。

mEGFP-Alfa-CD20は、Alfa-CD20をmEGFP-C1プラスミド(番号54759、Addgene)に挿入することによってクローン化した。 Alfa-CD20 gblock (Integrated DNA Technologies から入手) をプライマー cggcatggacgagct および gtacaagtccgga で増幅し、制限酵素 BsrGI および BamHI で切断した後、Gibson アセンブリを実行しました (2x mix、NEB)。

CHO 細胞は、トランスフェクションの前日に、ibidi 8 ウェル高ガラス底チャンバー (番号 80807) に 15,000 cm-2 の密度で播種されました。 mEGFP-CD20によるトランスフェクションは、製造業者の指定に従ってリポフェクタミンLTXを用いて実施した。 CHO 細胞に mEGFP-CD20 を 16 ～ 24 時間発現させました。 次に、培地を新鮮な F-12K 培地 + 10% FBS (未処理の場合) または F-12K 培地 + 10% FBS + 10 ug ml-1 RTX-Alexa 647 (Roche Glycart からの贈り物) に交換しました ( RTX 処理の場合)、その後 30 分間インキュベートします。 新鮮な培地で5分間2回洗浄した後、細胞を250μlの予熱したPBS中の4% PFA + 0.1% グルタルアルデヒドで15分間固定した。 CHO細胞をPBSで3回洗浄し、100 mM Tris pH 8.0で5分間クエンチした。 PBS中の0.2% Triton X-100を用いて5分間透過処理を行い、その後PBSで3回洗浄した。 細胞をブロッキング緩衝液中で室温(RT)で1時間ブロックした。 抗 GFP ナノボディを総濃度 25 nM で 4 °C で一晩インキュベートしました。 ４ラウンドのＲＥＳＩの場合、これにより、それぞれ６．２５ｎＭのＧＦＰ－Ｎｂ－Ｒ１／２／３／４が得られた。 ＰＢＳを用いて室温で１５分間３回洗浄した後、細胞を４％ＰＦＡを用いて室温で１０分間後固定し、続いて上記のように洗浄および後固定を行った。 金ナノ粒子 (90 nm) を PBS で 1:3 に希釈し、室温で 10 分間インキュベートし、サンプルを PBS で 2 回洗浄して未結合の金を除去しました。 最初のラウンドのバッファー C 中のイメージャー溶液を 5 分間インキュベートし、その後新しいイメージャーと交換し、その後、最初の取得ラウンドを開始しました。 イメージングラウンドの間に、前のイメージャー溶液からの残留シグナルが検出されなくなるまで、サンプルを少なくとも 2 ml の PBS で洗浄しました。 そこで次のイメージャーソリューションが導入されました。 RESI イメージングは​​、イメージャの 1 つだけを使用して、その後 4 回のイメージング ラウンドを介して実行されました。 最後のイメージング ラウンドでは、イメージャ R1、R2、R3、および R4 をサンプルに同時に追加して、標準的な DNA-PAINT 測定を実行しました。

蛍光イメージングは​​、油浸対物レンズ (Nikon Instruments、Apo SR TIRF × 100/開口数 1.49、油）。 560 nm レーザー (MPB Communications、1 W) を励起に使用しました。 レーザービームはクリーンアップフィルター (Chroma Technology、番号 ZET561/10) を通過し、ビームスプリッター (Chroma Technology、番号 ZT561rdc) を使用して顕微鏡の対物レンズに結合されました。 蛍光は発光フィルター (Chroma Technology、番号 ET600/50m および ET575lp) でスペクトル的にフィルター処理され、さらに拡大することなく sCMOS カメラ (Andor、Zyla 4.2 Plus) で画像化され、有効ピクセル サイズは 130 nm (2 倍後) となりました。 2ビニング）。 読み出し速度は 200 MHz に設定されました。 画像は、サイズ 512 × 512 ピクセルの関心領域を選択することによって取得されました。 検出経路にシリンドリカルレンズ (Nikon Instruments、N-STORM) を使用して 3D イメージングを実行しました。 生の顕微鏡データは、μManager41 (v.2.0.1) を使用して取得されました。 全反射照明は、2D および 3D DNA 折り紙データと CD20 取得に使用されました。 NPC データの取得には、高度に傾斜した積層光学シート (HILO) 照明が採用されました。 各実験の詳細な撮像条件を拡張データ表 1 に示します。

ターゲットとサンプルの不均一性により、まばらな点滅を実現するために使用される最適なイメージャ濃度 c は異なります。 ここでは、100 pM (Nup96) から 800 pM (DNA origami) までの濃度を使用しました。 最適なイメージャ濃度は、各サンプルについて視覚的に決定されました。 良好な DNA-PAINT 解像度が得られる程度にまばたきが頻繁ではあるがまばらになるまで、濃度を変更しました。

DNA-PAINT 測定中に結合部位ごとに予想される結合イベントの平均数は、測定時間 t 測定時間と平均暗時間 τdark (\({\tau }_{{\rm{dark}}} として定義) によって求められます) =\frac{1}{{k}_{{\rm{on}}}\times c}\)、kon は特定のイメージャ ストランドのオン率です) は次のようになります。

バインディング イベントごとのローカリゼーションの平均数は、平均明時間 τbright とカメラの露出時間 texposure によって次のように与えられます。

したがって、測定中に結合部位ごとに予想される局在化の平均数は次のようになります。

したがって、nloc ローカリゼーションを収集するために必要な合計取得時間は、平均して次のようになります。

必要なローカリゼーションの数 nloc は、 \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{DNA}} \mbox{-} { を使用して計算されます) \rm{PAINT}}}}{\sqrt{{n}_{{\rm{loc}}}}\)、つまり \({n}_{{\rm{loc}}}={\ left(\frac{{\sigma }_{{\rm{DNA}} \mbox{-} {\rm{PAINT}}}}{{\sigma }_{{\rm{RESI}}}}\right )}^{2}\) を DNA-PAINT 位置特定精度 σDNA-PAINT で指定します。

予想されるイメージャ濃度 50 ～ 800 pM、露光時間 100 ～ 200 ms、および以前に報告された反応速度 32 の場合、16 個の局在化 (σDNA-PAINT = 4 nm の場合の RESI 精度 1 nm) を収集するのに必要な時間は 42 秒 (R2、800 pM、100 ms 露光時間）および 314 分（R5、50 pM、200 ms 露光時間）。

生の蛍光データは、Picasso ソフトウェア パッケージ 9 (https://github.com/jungmannlab/picasso で入手可能な最新バージョン) を使用して超解像度再構成を受けました。 ドリフト補正は、細胞実験の基準として冗長相互相関と金粒子を使用して、または折り紙実験の基準として単一の DNA-PAINT ドッキング サイトを使用して実行されました。

その後のイメージングラウンドのアライメントは、冗長相互相関から始まり、細胞実験用の金基準アライメントが続く、Picasso9 で繰り返し実行されました。 すべての DNA オリガミには、すべてのイメージング ラウンドで対象部位と同時にイメージングされる追加の DNA-PAINT ドッキング サイトが装備されており、基準として使用できるようになりました。 まず、冗長相互相関 (2D および 3D 折り紙測定) と金位置合わせ (3D 測定) が Picasso Render で実行されました。 バッファー交換中の個々の DNA オリガミのナノスケールの動きを補正するために、全視野でチャネル アライメントを実行するだけでなく、さらに 1 つの DNA オリガミのみを含む小さな関心領域が選択されました。 次に、各関心領域内で、DNA 折り紙の基準ドッキング サイトを介して位置合わせが実行されました。 これは、チャンネル間の最適な変換を見つけるためだけでなく、DNA オリガミの回転の可能性を修正するために、カスタム Python スクリプトで Picasso の外部で実行されました。

チャネルアライメント後、イメージングラウンドごとにカスタムクラスタリングアルゴリズムを使用して DNA-PAINT データを分析しました。 このアルゴリズムは、DNA-PAINT では、位置特定はターゲット分子の位置の独立した測定値であり、ガウス分布であることが観察されるという事実に基づいています。 特定のターゲット分子に局在化を割り当てるために、まず勾配上昇法を使用して各ターゲットの局在化クラウドの中心を見つけました。 次に、中心点の周りに円状に分布するすべての局在化を同じ標的分子に割り当てました。 RESI の逐次イメージング手法による実効ターゲット密度の減少により、単一ターゲットからの局在化雲の大部分が十分に離れているため、これは有効な近似値です。

クラスタリング アルゴリズムは 2 つの入力パラメーターを使用します。1 つはクラスターの最終サイズを設定し、各ローカリゼーションの周囲の円形環境を定義する半径 r、もう 1 つはローカリゼーションの最小数 nmin で、DNA-PAINT ローカリゼーションの数の下限しきい値を表します。任意のクラスター。

まず、各位置から距離 r 以内にある隣接する位置の数が計算されます。 特定のローカライゼーションの r 半径内にすべての隣接ローカライゼーションよりも多くの近傍がある場合、それは極大値とみなされます。 このような極大値の周囲の半径 r の円内に nmin を超える局在化がある場合、これらの局在化は同じクラスターに割り当てられます。 残りはクラスターの一部とみなされず、さらなる分析から除外されます。

さらにクラスターのフィルタリングが実行され、サンプルへのイメージャの不特定の付着に起因するクラスターが除外されます。 まず、同一クラスタに属する全ての定位の平均フレーム（定位が発生したフレーム番号の平均値）を計算する。 反復的な点滅の場合、平均フレームは総フレーム数の約半分であると予想されます42。 したがって、アルゴリズムはフレームの最初または最後の 20% に平均フレームを持つすべてのクラスターを除外します。 次に、取得時間を 5% のフレームを含む 20 の時間ウィンドウに分割することで、取得時間の途中で発生したスティッキング イベントを特定できます。 これらの時間枠のいずれかにクラスター内のローカリゼーションの 80% 以上が含まれている場合、それは固着イベントとして除外されます。

クラスタリング半径 r としきい値 nmin の選択は、それぞれの実験条件によって異なります。 nmin の適切な値は、Picasso Render で単一ターゲット分子 (つまり、十分に分離された) に由来するローカリゼーション クラウドを選択し、ピック プロパティをエクスポートして、各ピックのローカリゼーション数のヒストグラムをプロットすることで推定できます。 nmin は、単一の標的に対応する集団とバックグラウンドの局在化​​に対応する集団を区別するために選択されます。

半径 r は、ローカライゼーション雲のサイズ、つまりローカライゼーションの精度に応じて変化します。 選択した値が大きすぎると、隣接するクラスターが分離されない可能性があります。 r が小さすぎる場合、1 つのローカリゼーション内で「サブクラスタリング」が発生する可能性があります。 後者は、クラスタリング半径の 2 倍の位置にある NND のピークにも変換されます。 r の適切な先験的開始値は、基礎となる DNA-PAINT 測定の位置特定精度の約 2 倍で表されます。 Picasso Render は、小さな関心領域に対してさまざまなクラスタリング パラメータの効果をテストできるツール (Test Clusterer) を提供します。

3D クラスタリングの場合、z 方向の局在化の広がりが x および y に比べて約 2 倍大きいため、z 方向に追加の半径が導入されます。

クラスター分析に続いて、DNA-PAINT ローカリゼーション グループの中心が、ローカリゼーション精度の二乗逆関数を使用して重み付け (wtd) 平均として計算されました \((\frac{1}{{{\text{lp}}}^{2} })\) を重みとして使用します。 x 座標と y 座標の場合:

Z 座標の場合、重みのない標準平均が Z 位置の計算に使用されます。 結果として得られる RESI ローカリゼーションの精度は、基礎となるグループ化されたローカリゼーションの重み付けされた sem です。

重みとしての \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) の選択は、次の議論に基づいています。ローカリゼーションは独立しており、同じ平均で正規分布しているという仮説の下では、重み付き平均は次の議論に基づいています。逆分散を重みとして使用することは、ローカリゼーションのセット全体の平均の最尤推定量です。 したがって、個々の測定値の逆分散 \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) が重みとして選択された場合、加重平均の分散は最小になります (推定量が最適になります)。

最後に、結果として得られる x および y sem の平均を、各 RESI ローカリゼーションの最終精度とします。 z 座標の場合、精度は xy 精度の 2 倍と推定されます。 RESI ローカリゼーションを Picasso hdf5 ファイルに保存すると、それぞれの精度に対応する SD を備えたガウスとしてレンダリングできるようになりました。

RESI のパフォーマンスを評価するために、コンピュータでの数値シミュレーションが実行されました。 アルゴリズムは次のステップで構成されます。

結合部位の定義された位置のグリッド (グランド トゥルース) が生成されます。 通常、位置のグリッドが生成されました (拡張データ図 1a、左上)。

SMLM (DNA-PAINT) の位置特定は、σ = σSMLM の 2D ガウス分布からのサンプルとしてシミュレートされます。 結合部位ごとに多数 (M) の局在化が生成されます (拡張データ図 1a、右上)。

各結合部位について、K 局在化のサブセットがランダムに選択されます (K << M)。 これにより、SMLM ローカリゼーションの \(n=\frac{M}{K}\) 個のサブセット (拡張データ図 1a、左下) が得られ、これらが平均されて n 個の RESI ローカリゼーションが生成されます (拡張データ 図 1a、右下)。 。

結果の RESI 局在化はヒストグラム (拡張データ図 1b) に表示され、共分散行列のトレース (tr) が計算されます。 RESI 精度は次のように推定されます \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\sqrt{\frac{1}{2}tr({\rm{cov}}\left(x,y\right) ))}\) (拡張データ図 1c)。 この定義は、以前にも 2D 分散のスカラー メトリックとして現場​​で使用されていました8。

ステップ 3 と 4 をさまざまな K 値に対して繰り返し、σ = σRESI(K) を数値的に調べます。

実験データにおける RESI の精度を評価するために、同様の方法が使用されました。 簡単に言うと、単一の結合部位に対応する各グループの DNA-PAINT 局在の合計 M 個をランダムに再サンプリングして K 局在のサブセットにし、上記のステップ 4 および 5 を実行して σRESI を評価しました。 図3dにプロットされたσRESIは、データセット内のすべての単一結合部位の平均値です。 エラーバーは、異なる結合部位について計算された異なる σRESI 値の標準偏差を表します。

この分析は、統計的に有意な推定に十分な \(n=\frac{M}{K}\) RESI 局在化が得られる K << M に対してのみ実行できることに注意してください。 最終的な RESI ローカリゼーションでは M 個の DNA-PAINT ローカリゼーションがすべて考慮されるため、最終的な精度は \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM) として推定されます。 }}}}{\sqrt{M}}\)。

RESI では、単一種の生体分子を異なる直交 DNA 配列で標識することで、サンプル内の結合部位のまばらさを実現します。 標識プロセスは確率論的に実行されます。同じタンパク質種をターゲットとする n 個の異なる標識 (DNA 結合ナノボディなど) がサンプル中で同時にインキュベートされるため、各単一タンパク質が特定の配列 i (i) で標識される確率は高くなります。 = 1, …, n) は、各ラベルの同じ濃度が使用されると仮定すると、\({p}_{i}=\frac{1}{n}\) となります。 続いて、n 回のイメージング ラウンドが実行され、最終的な RESI 画像を取得するために必要な位置特定のすべてのグループが記録されます。

各イメージング ラウンドで結合部位の十分な疎性を達成するために必要なラベルの最小数 (n) とラウンドは、主に 3 つの要素、SMLM 局在化の精度と密度、および目的のタンパク質の分子配置によって決まります。 ここでは、いくつかの実際的な例を使用して、これらのパラメーターが最終的な RESI 結果にどのように影響するかを説明します。

典型的な研究ケースは、二量体に配置された単一タンパク質のケースであり、これにより空間内に別の特定の空間構成が示されます。 これは、たとえば NPC の Nup96 の場合です。 この場合、確率的標識は、異なる配列を持つ二量体を形成する 2 つのタンパク質を標識する確率が十分に高くなるようなものでなければなりません。 n 回のラベル付け/イメージングの場合、確率は次のようになります。

n = 4 のラベリング/イメージング ラウンドの場合、P(diff. seq.) ≈ 75%。 わずか数回のイメージングラウンドで比較的高い P(diff. seq.) が得られることを実証するために、n = 4 を選択しました。 ただし、n > 4 を使用すると P(diff. seq.) を増加させることができ、したがって各ラウンドでの標識結合部位のまばらさを最大化できることに注意してください。

DNA-PAINT の分解能よりも狭い間隔で配置された任意の数 m の分子のセットを分解するには、それらを n 個の直交配列で標識する必要があります。 一般に、n 個の直交配列で標識された m 個の分子の割合、つまり分解可能な分子セットの割合は次の方程式に従います。

これは、たとえば膜受容体の場合によくあるケースです。 タンパク質が特定の密度で CSR 形式で分布している場合 (拡張データ図 14a)、DNA-PAINT は、NN から十分に離れた単一タンパク質をすでに解決できます。 距離 d = 4 × σDNA-PAINT にあるタンパク質は確実に分離されると考えます (この基準は 2.35 × σDNA-PAINT よりも大幅に厳しいことに注意してください)。 次に、特定の密度について、NND ヒストグラムを計算し、d 未満の距離の割合を計算できます (拡張データ図 14b)。 これは、DNA-PAINT によって解決されない単一タンパク質 F の割合を表します。 ここで、密度と解像度の両方の関数として F をプロットします (拡張データ図 14c)。 このようなマップは、特定の密度で単一タンパク質を分離するために必要な SMLM 解像度のレベルを理解するためのツールをすでに提供しています。

ここでの RESI は、ターゲットを確率的にラベル付けされた異なるサブセットに分割することによって実効密度を下げる方法として解釈できます。 したがって、各ラウンドの実効密度は、式 \(\rho =\frac{{\rm{density}}}{n}\) に従って減少します。 拡張データ 図 14d は、RESI を効率的に実行できるようにするために必要な直交シーケンス (したがってイメージング ラウンド) の数を選択するためのガイドラインを提供する 2D マップの 1 次元カットを示しています。 たとえば、初期解像度が 20 nm (σ = 5 nm) の場合、これは細胞内での DNA-PAINT に一般的であり、密度は \({\rm{d}}{\rm{e}}{ \rm{n}}{\rm{s}}{\rm{i}}{\rm{t}}{\rm{y}}=200\,\frac{{\rm{m}}{\ rm{o}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm{c}}{\rm{u}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm {s}}}{\mu {{\rm{m}}}^{2}}\) (比較的高い)、タンパク質の P(diff. seq.) ≈ 90% を提供するには、n = 4 つの異なる配列で十分です以下 d (拡張データ図 14d)。 これらのタンパク質は RESI によって分解可能になります。

Wu et al.30 によって説明されているように、Nup96 データのモデルフリー平均化は、同じ核の DNA-PAINT 測定と RESI 測定の両方に対して実行されました。 それぞれの Picasso hdf5 ファイルは SMAP43 でセグメント化され、segmentNPC、NPCsegmentCleanup、sitenumbers2loc プラグインを使用して平均化と互換性のあるファイル形式で保存されました。 次に、Matlab でarticleFusion.m スクリプト (SMAP ソース コードで利用可能) を実行することにより、結果の _sml.mat ファイルに対してデフォルトのパラメーターを使用してモデルフリー平均化が実行されました。 示された平均は、各点が x、y、z の σ = 2 nm のガウス分布でレンダリングされる最終反復の結果に対応します。

未処理細胞の NND データの結果を解釈するために、数値シミュレーションを実行しました。 簡単に言うと、CSR 分布を持つ CD20 単量体と二量体の 2 つの集団をシミュレートし、それらの NND を計算しました。 アルゴリズムは次のように要約できます。

パラメータの選択。 モノマーの密度: 単位面積あたりのモノマーの数。 二量体の密度：単位面積当たりの二量体の数。 二量体距離: 標識構造を含む 2 つの分子間の予想される距離。 不確実性: 標識および局在化エラーによる各分子の位置の変動。 標識効率: 実際に標識され測定されるグランドトゥルース分子の割合。 観察された密度は実験パラメータと一致する必要があり、観察された密度 = (モノマーの密度 + 二量体の密度) × 標識効率となります。 DNA 結合 GFP ナノボディの標識効率を定量化するために、単量体膜​​タンパク質 (CD86 など) の C 末端に GFP および Alfa タグを発現する一時的にトランスフェクトされた CHO 細胞株を使用しました。 次に、2 つの直交するドッキング配列に結合した同族ナノボディを使用して GFP タグと Alfa タグを標識し、2 ラウンドの Exchange-PAINT を実行しました。 次に、CD20 ダイマー/モノマー分析の実行方法と同様に、GFP/Alfa タグのペアと分離された Alfa タグを含むサンプルに最適なパラメーターを取得しました。 これら 2 つの集団の比率は、標識効率の推定値として使用されます。 定量化アプローチの詳細については、現在準備中の原稿で公開される予定です。

モノマーのシミュレーション: CSR 分布と所定の密度を含む一連の空間座標が描画されます。 二量体のシミュレーション: CSR 分布を含む一連の空間座標が描画され、各二量体の中心を表します。 各二量体中心について、ランダムな方向と期待値二量体距離による距離を使用して 2 つの位置が生成されます。 分子の各ペアの位置は、(ガウス分布から引き出された) 不確実性パラメータを考慮して描かれます。

「検出可能な」分子のランダムなサブセットがグラウンド トゥルース セット (割合 = 標識効率) から取得され、標識プロセスをシミュレートします。

NND は、検出可能な分子のサブセットに基づいて計算されます。

モノマーの密度 = 212 μm-2、ダイマーの密度 = 0 μm-2、不確実性 = 5 nm、および標識効率 = 50% のパラメータを使用して、RTX 処理細胞のデータとモノマーの CSR 分布を比較しました。

未処理のケースでは、反復的な非線形最小二乗アルゴリズムを通じて最適パラメータが取得されました。 実験的に観察された密度 (50 分子 µm–2) がシミュレーションに使用されます。

パラメータのセットごとにシミュレーションが実行され、NND がヒストグラム化され、シミュレーションと実験のヒストグラムの差の二乗の合計が計算されます。 近似は、差の二乗の合計を最小化するパラメーターを見つけることで構成されます。

D、平均二量体距離 (nm)

σ_label、ラベリングによって導入された変動性 (nm)

frac_of_dimers、二量体の割合 (%)

注: frac_of_monomers = 100 – frac_of_dimers

広範囲のパラメータにわたって粗適合を行い、最適なパラメータの範囲を決定します。 範囲 D = 1 ～ 20 nm、σ_label = 1 ～ 20 nm、frac_of_dimers = 0 ～ 100%。

前のステップでの最適な結果の周囲の縮小されたパラメーター空間で微調整します。

提案されたモデルとデータに最もよく一致するパラメーター D_opt、σ_label_opt、および frac_of_dimers_opt が見つかりました。 この場合、D_opt = 13.5 nm、σ_label_opt = 5.5 nm、frac_of_dimers_opt = 47%という結果になりました（図4e、f）。

M が作成され (この場合、M = 100)、実験データと同じ分子数 (約 21,000) でシミュレーションされます (データセット D_opt、σ_label_opt、frac_of_dimers_opt を使用)。

M 個のデータセットが細かく適合され、最適なパラメーター D_opt、σ_label_opt、および frac_of_dimers_opt が取得されます。 D_opt、σ_label_opt、および frac_of_dimers_opt の 3 つのセットが取得されます。

D_opt、σ_label_opt、およびfrac_of_dimers_optの分布が研究されます。 標準偏差は、b で得られたパラメータの不確実性の推定値として使用できます。

パラメータ D_opt、σ_label_opt、frac_of_dimers_opt の不確実性が得られます。

この研究のローカリゼーション データは Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7795826) で入手できます。 この研究中に得られた生の顕微鏡データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

RESI は、https://github.com/jungmannlab/picasso で入手可能な Picasso v.0.6.0 を使用して実行できます。ドキュメントは https://picassosr.readthedocs.io/en/latest/render.html で提供されます。 この調査で使用したカスタム作成スクリプトは、https://github.com/jungmannlab/resi で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

Y.-Lに感謝します。 Wu と J. Ries は、モデルフリー平均化に関して貴重な支援をしていただきました。 有益な議論をしていただいた J. Schmied 氏と F. Schueder 氏に感謝します。 原稿の校正をしていただいた MK Steen-Mueller 氏と I. Glueck 氏に感謝します。 この研究は、ERC Consolidator Grant (ReceptorPAINT、助成契約番号 101003275) を通じて欧州研究評議会、SFB1032 を通じてドイツ研究財団 (プロジェクト A11、番号 201269156)、デンマーク国立研究財団 (Centre for Cellular) から一部資金提供を受けました。信号パターン、DNRF135)、若手研究者助成金によるヒューマンフロンティア科学プログラム (番号 HFSP RGY0065/2018)、イニシアチブ「Life?—生命の基本原理への新鮮な科学的アプローチ」によるフォルクスワーゲン財団 (助成金番号98198)、マックス プランク財団およびマックス プランク協会。 SS と TS は、QBM 大学院からの支援を認めます。 SCMR、IB、PRS、ASE、EMU、および MTS は、IMPRS-LS 大学院による支援を認めています。 IBはロシュによる資金援助を認めています。 LAMは、Marie Skłodowska-Curie助成金契約第2号に基づく欧州連合のHorizo​​n 20212022研究革新プログラムからの博士研究員としてのフェローシップを認めました。 101065980。

マックス・プランク協会が提供するオープンアクセスの資金提供。

これらの著者は同様に貢献しました: Susanne CM Reinhardt、Luciano A. Maello、Isabelle Baudrexel、Philipp R. Steen

マックス・プランク生化学研究所、プラネック、ドイツ

スザンヌ・CM・ラインハルト、ルチアーノ・A・マスーロ、イザベル・ボードレクセル、フィリップ・R・スティーン、ラファル・コワレフスキー、アレクサンドラ・S・エクランド、セバスティアン・シュトラウス、エドゥアルド・M・ウンターラウアー、トーマス・シュリヒターレ、マクシミリアン・T・シュトラウス、ラルフ・ユングマン

ドイツ、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学物理学部およびナノサイエンスセンター

スザンヌ・CM・ラインハルト、フィリップ・R・スティーン、ラファル・コワレフスキー、セバスティアン・シュトラウス、エドゥアルド・M・ウンターラウアー、トーマス・シュリヒターレ、マクシミリアン・T・シュトラウス、ラルフ・ユングマン

ルートヴィヒ・マクシミリアン大学、化学・生化学学部、ミュンヘン、ドイツ

イザベル・ボードレクセル、アレクサンドラ・S・エクランド、クリスチャン・クライン

ロシュ イノベーション センター チューリッヒ、ロシュ ファーマ研究および初期開発、シュリーレン、スイス

クリスチャン・クライン

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SCMRは、2Dおよび3D DNAオリガミおよびNup96実験の設計と実施、解析ソフトウェアの開発、DNAオリガミとNup96データの解析を行いました。 LAM はコンピュータ シミュレーションを設計および実施し、解析ソフトウェアに貢献し、DNA オリガミ、Nup96、CD20 データを解析しました。 IB は CD20 実験を設計および実施し、CD20 データを分析しました。 PRS は 2D DNA オリガミ実験を設計および実施し、解析ソフトウェアに貢献し、DNA オリガミと Nup96 データを解析しました。 RK と TS は解析ソフトウェアに貢献しました。 SS は標識プローブを開発しました。 ASE、SS、EMU、および MTS は予備的な RESI 実験を実行しました。 CK は、CD20 を対象とした研究のデザインとその解釈に貢献しました。 SCMR、LAM、IB、PRS、RJ はデータを解釈し、原稿を執筆しました。 RJ はコンセプトを考案し、実験を計画し、研究を監督しました。 SCMR、LAM、IB、PRS も同様に貢献しました。 著者全員が最終原稿を確認し、承認しました。

ラルフ・ユングマンへの手紙。

CK は、Roche との雇用、特許 (本研究とは無関係) および株式所有権を宣言します。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Alistair Curd と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、定義された結合部位の位置のグリッドが生成され (左上)、SMLM (DNA-PAINT) の位置がガウス分布からのサンプルとしてシミュレートされます (右上)。 明確にするために、1 つの結合部位のみの局在をプロットしました。 各結合部位について、K 局在のサブセットがランダムに選択され (左下)、平均化されます (右下)。 １つの例示的なサブセットとその平均が強調表示されている。 b, 結果として得られる RESI 位置特定は、さまざまな解像度 (K 値) で画像を生成するためにヒストグラム化されます。 c、RESI 位置特定精度 σRESI 対 K。 \(\sqrt{K}\) への解析依存性 (青線) と数値結果 (黒点)。 サイトごとに合計 1200 の SMLM ローカリゼーションがシミュレートされます。 エラーバーは平均±1 sdを表す

a、5 nm間隔の6つの直交ドッキング鎖ペア（赤色R1、青色R3）と6つの整列ドッキング鎖（緑色R4）を特徴とするDNA折り紙デザイン。 シーケンスの詳細については、「メソッド」を参照してください。 b、DNA-PAINT 取得パラメータは、5 nm が一貫して分解できないように調整されました。 c、最初のイメージング ラウンドは、R1 (ターゲット) および R4 イメージャー (位置合わせ、丸で囲んだ部位) を使用して実施されました。 ｄ、第２のイメージングラウンドは、Ｒ３（ターゲット）およびアライメントイメージャ（Ｒ４、丸で囲まれた部位）を用いて実施された。 アライメント部位は、ラウンド間の並進および回転アライメントに使用されました。 e、RESI は 5 nm の距離を分解します。 f、R1 と R3 のドッキング ストランド間の距離と方向は設計と一致しています。 g. 平均 90 個の DNA 折り紙構造から、一貫した結果と優れたアライメント性能が明らかになります。 数字はラウンド間の距離を示します。

測定視野全体から見た代表的な DNA 折り紙。 a、4 つの DNA 折り紙。DNA-PAINT 解像度 (上の行) と RESI 解像度 (下の行) で示されています。 挿入図には、約 1.5 mm の間隔で配置された一対のドッキング ストランドが示されています。 5nm。 b、追加の 40 枚の DNA 折り紙。DNA-PAINT 解像度 (上の行) と RESI 解像度 (下の行) で示されています。

a、1 対の直交ドッキング ストランド (赤 R1、青 R3) と 6 本の整列ドッキング ストランド (緑 R4) を特徴とする DNA 折り紙デザイン。 ドッキングストランドは、DNA 折り紙の上面と下面の両方から伸びています (インサート)。 b. この設計では、R1/R3 ドッキング鎖ペア以外のすべてが、DNA-PAINT によって解決されるのに十分な間隔があることが保証されます。 c、3D DNA-PAINT イメージングは​​ R4 アライメント部位を分解しますが、R1/R3 は軸方向にはかろうじて分解され、R1/R3 は横方向には分解されません。 d、アライメントに使用される R4 サイトを使用した連続 3D DNA-PAINT イメージング。 e、RESI は R1/R3 を軸方向と横方向の両方に分解します。 f. 88 個の DNA 折り紙を重ね合わせると、構造的不均一性にもかかわらず、全体的に良好な位置合わせが示されます。 g、88 個の DNA 折り紙の平均。 h、粒子平均は、0.7 nm CI = [0, 1.6] nm のアライメント不確実性で構造を回復し、平均 R1/R3 位置間の距離が 11.6 ± 0.8 nm (xy 距離: 2.5 ± 0.4 nm、z) であることを示します。 -距離: 11.3 ± 0.8 nm)、設計された距離と一致します20。 同じスケールがすべての拡大パネルに適用されます。 CI は 68% 信頼区間を表します。

測定視野全体から見た代表的な 3D DNA 折り紙。 a、5 つの DNA 折り紙。DNA-PAINT 解像度 (上段) と RESI 解像度 (下段) で表示されます。 右側のカラー スケールは、ローカリゼーションの Z 位置を表します。 各 DNA 折り紙の測定された z 座標は、特定の構造の最低局在性が z = 0 になるように定義されるように、定数だけシフトされています。これにより、色範囲を最大限に活用することが保証されます。 b、32 個の追加の DNA 折り紙。DNA-PAINT 解像度 (上の行) と RESI 解像度 (下の行) で示されています。 Z 位置は、パネル a のカラー スケールに従って色付けされます。

測定の視野全体からの代表的な NPC。 a、6 人の NPC、DNA-PAINT (上段) と RESI (下段) を使用して測定。 右側のカラー スケールは、ローカリゼーションの Z 位置を表します。 各 NPC の測定された z 座標は、特定の構造の最低局在性が z = 0 になるように定義されるように、定数だけシフトされています。これにより、色の範囲を最大限に活用することが保証されます。 b、追加の 72 NPC。DNA-PAINT (上の行) と RESI (下の行) を使用して測定。 Z 位置は、パネル a のカラー スケールに従って色付けされます。

a、Nup96 の DNA-PAINT 測定のモデルフリー平均 (N = 1045 NPC)。 斜めの等角図が示されています。 b-d、DNA-PAINT は核質環と細胞質環を分解し、その 8 回対称性を再現しますが、個々の Nup96 タンパク質を分解することはできません。 e, 両方のリングのすべての Nup96 ペアの側面図では、角度のある配向が明らかになりますが、個々の Nup96 タンパク質は分解されません。 f、Nup96 の RESI 測定のモデルフリー平均 (N = 1190 NPC)。 g–i、RESI は、核質環と細胞質環およびその 8 回対称性を再現し、ほとんどの場合、隣接する個々の Nup96 タンパク質を分解します。 j. 両方のリングの 8 つすべての Nup96 ペアの側面図は、角度のある配向と、場合によっては隣接する個々の Nup96 タンパク質を明らかにします。 k. 核膜孔複合体の Cryo-EM 構造は、特定の Nup96 タンパク質が 11 nm、39 nm、71 nm、93 nm、および 101 nm の間隔で隣接するタンパク質を有することを示しています。 l、DNA-PAINT データのクラスタリングと最近傍分析を実行すると、約 100 μm のピークが明らかになります。 40 nm、2 つの Nup96 ペア間の距離に相当しますが、それ以下ではありません。 一方、RESI は、最初のピークが約 100 mA にあるのが特徴です。 リンケージエラー（ラベルサイズ）を考慮した場合の隣接するNup96間の距離に相当する15 nm。 m、RESI および DNA-PAINT の 1 番目から 10 番目までの最近接距離の分析では、(k) からの距離が再現されますが、RESI のみが最小距離を解決します。 すべてのスケール バー: 20 nm。

測定視野全体から見た代表的な DNA 折り紙。 a、4 つの DNA 折り紙。DNA-PAINT 解像度 (上の行) と RESI 解像度 (下の行) で示されています。 インサートは、RESI によって分離された直接隣接するドッキング鎖のペアを示しています。 b、42 個の追加の DNA 折り紙。DNA-PAINT 解像度 (上の行) と RESI 解像度 (下の行) で示されています。

a、1 塩基対離れた 6 本のアラインメント鎖 (緑色 R4) と 6 対の直交ドッキング鎖 (赤色 R1、青色 R3) を特徴とする DNA オリガミ。 b、ラウンド 1 の RESI 局在化を赤、ラウンド 2 を青で示した RESI 表現は、優れた位置合わせを示しています。 ラウンド 1 とラウンド 2 の RESI 局在化間の距離は、図のように定義されます。 c. 42 個の DNA 折り紙を重ねて粒子平均を実行すると、1.2 Å CI = [0, 4.6] Å のアライメント不確実性を持つ構造が復元され、サイトの平均位置間の距離が 9.5 ± 2.6 Å であることがわかります (6 つの距離の平均)平均 ± 6 つの距離の誤差伝播の不確実性の平均)。 同じスケールがすべての拡大パネルに適用されます。 CI は 68% 信頼区間を表します。

a、抗GFPナノボディで標識されたmEGFP-CD20発現CHO細胞全体のDNA-PAINTイメージングは​​、3つの独立した実験において均一に分布した分子を示しています。 b. DNA-PAINT の拡大領域は、二量体を解決できなかったケースを示しています。 c、RESIは、10nm未満の間隔の受容体ペアを明らかにしますが、これはDNA-PAINTの場合では解決できません。 d、CD20受容体の最初の最近傍距離（1st NND）の全細胞分析（距離のヒストグラムが表示されます）。 タンパク質間の 10 nm 未満の距離を日常的に検出できるのは、DNA-PAINT ではなく RESI だけです。 e、1 nm 未満の RESI 位置特定精度により、10 nm 未満の距離の日常的な検出が可能になり、最初の NND を正確に評価できます。

a、RTXで処理したmEGFP-CD20発現CHO細胞のDNA-PAINT概要画像。 b. DNA結合抗GFPナノボディによる標識とDNA-PAINTによるイメージングにより、RTX処理後の高次組織が明らかになります。 RESI (挿入図 i ～ iii) は分子分解能を達成し、それによって mEGFP-CD20 の分子配置を分解します。 c、DNA-PAINT イメージングでは、クラスター化された CD20 分子が示されています。 4 つの別々のイメージング ラウンド (色分け) でシーケンス R1、R2、R3、および R4 を使用して RESI を実行すると、単一のターゲットに由来する位置のクラスタリングが可能になります。 クラスター化された局在化から RESI 局在化が計算され、真の単一タンパク質の解決が可能になりました。

a、抗GFPナノボディで標識されたmEGFP-CD20発現CHO細胞全体のDNA-PAINTイメージングは​​、3つの独立した実験においてリツキシマブ処理細胞内でクラスター化されたCD20分子を示しています。 b、DNA-PAINT のズームイン領域は、mEGFP-CD20 が鎖状にクラスター化されていることを示しています。 c、RESIは、クラスター内に10nm未満の間隔で配置された受容体ペアを明らかにし、DNA-PAINTでは解決できません。 d、リツキシマブに結合したCD20受容体の最初の最近隣距離（1st NND）の全細胞分析（距離のヒストグラムが表示されます）。 タンパク質間の 10 nm 未満の距離を日常的に検出できるのは、DNA-PAINT ではなく RESI だけです。 e. RESI による 10 nm 未満の距離の日常的な検出は、未処理の場合に測定された最初の NND を再現します。 特に、タンパク質密度とは無関係に、3 つのリピートで測定された NND ピークは一貫しています。

a、実験的に決定された密度で2D表面上にランダムな分布と配向を持つ、グランドトゥルースでシミュレートされたCD20六量体の例（水色の円、実験的に測定された二量体内距離が13.5 nmの二量体の三角形としてシミュレート）。 b. 現実的な比較のために、シミュレーションではラベルの不確実性とラベル効率 (黒丸はラベルされた分子を示します) が考慮されます。 c. ガウス分布として表される六量体配置のシミュレートされたタンパク質。 d、DBSCAN クラスター分析後の六量体 (色はクラスターを示します)。 e、RTX処理後のCD20データのRESI画像。 f、DBSCAN クラスター分析後の CD20 データの RESI 局在化 (色はクラスターを示します)。 g、実験データおよびシミュレートされた六量体について検出されたクラスターごとの分子の数。 h、クラスターの凸包分析後の実験データとシミュレートされた六量体の円形度メトリック。 0.605 での急激な低下は、凸包が 3 つの分子によって定義されるクラスターの最大円形度メトリックから生じていることに注目します。 特に、実験データには約 0.7 の円形度ピークが存在しないことは、CD20 分子が孤立した環状六量体構造に配置されていないことを示唆しています。

a. 特定の密度の完全空間ランダム (CSR) 分布によるタンパク質の例示的なシミュレーション。 b、最近傍距離 (NND) のヒストグラム。 赤い線は、指定された一連のイメージング パラメーターに対して DNA-PAINT によって解決できる最小距離 (d) を示します。 この距離閾値未満の NN を持つ分子の割合 (青、影付き) は、指定された密度と指定された DNA-PAINT 解像度で計算できます。 c、密度と解像度の関数としての非分離分子の割合の 2D マップ。 d、c の異なる解像度 (色分け) での 1D カットは、分解不可能な距離の特定のターゲット部分を考慮して RESI を効率的に実行するために必要な多重化ラウンド数を推定するためのユーザー ガイドとして使用できます。

サブナノメートル、5 nm、および 20 nm 間隔の結合部位を備えた 2D DNA オリガミのステープルストランド シーケンスと、3D オリガミのステープルストランド シーケンス。

2D DNA 折り紙の足場鎖配列 (M13mp18)。

3D DNA 折り紙の足場鎖配列 (p7560)。

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Reinhardt、SCM、Masullo、LA、Baudrexel、I. 他オングストローム分解能の蛍光顕微鏡。 ネイチャー 617、711–716 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

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受信日: 2022 年 7 月 21 日

受理日: 2023 年 3 月 7 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

発行日: 2023 年 5 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

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