エブセレン誘導体はSARSを抑制する

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9161 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

SARS-CoV-2 によってコードされるプロテアーゼは、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) に対する新しい治療法の有望な標的となります。 SARS-CoV-2 の主要プロテアーゼ (Mpro、3CLpro) とパパイン様プロテアーゼ (PLpro) は、ウイルスの生存と複製に重要なプロセスであるウイルスのポリタンパク質の切断に関与しています。 最近、有機セレン抗炎症性小分子薬である 2-フェニルベンズイソセレナゾール-3(2H)-オン (エブセレン) が、両方のプロテアーゼの強力な共有結合阻害剤であることが示され、その効力が酵素アッセイおよび抗ウイルスアッセイで評価されました。 この研究では、SARS-CoV-2 PLpro 阻害剤および Mpro 阻害剤について、34 種類のエブセレンおよびエブセレンジセレニド誘導体のコレクションをスクリーニングしました。 私たちの研究により、エブセレン誘導体が両方のプロテアーゼの強力な阻害剤であることが明らかになりました。 私たちは、エブセレンより優れた 3 つの PLpro 阻害剤と 4 つの Mpro 阻害剤を特定しました。 独立して、エブセレンは、ウイルスのRNAキャップ修飾に関与するSARS-CoV-2 nsp14タンパク質のN7-メチルトランスフェラーゼ活性を阻害することが示された。 したがって、選択された化合物は nsp14 阻害剤としても評価されました。 研究の第 2 部では、11 種類のエブセレン類似体 (ビス(2-カルバモイルアリール) フェニル ジセレニド) を生物学的アッセイに使用し、Vero E6 細胞における抗 SARS-CoV-2 活性を評価しました。 我々は、それらの抗ウイルス活性と細胞保護活性、そして低い細胞毒性を紹介します。 私たちの研究は、エブセレン、その誘導体、およびジセレニド類似体が、SARS-CoV-2 ウイルスを標的とする新しい抗ウイルス薬の開発のための有望なプラットフォームを構成することを示しています。

2019 年の冬、中国の武漢でインフルエンザのような症状を伴う肺炎が発生しました 1,2。 その後すぐに、病気の原因となる病原体が分離および分析され、感染力の高い新規のヒト ベータ コロナウイルス SARS-CoV-2 (以前は 2019-nCoV として知られていました)3 が特定されました。 2023 年 2 月までに、6 億 7,400 万人以上が 2019 年コロナウイルス感染症 (COVID-19) と診断され、死亡者数は世界中で 686 万人を超えました4。 新しく開発された新型コロナウイルス感染症（COVID-19）ワクチンは、ウイルススパイクタンパク質（S）の免疫原性に依存しているが、新たなSARS-CoV-2懸念変異種（VOC）の出現により、より保存された非構造タンパク質（nsps）を標的とする新しい抗ウイルス薬の必要性が浮き彫りになっている。ウイルスの影響5、6。 病原体と戦うための効果的な治療法の発見を促進するために、さまざまな戦略が採用されています7。 これらの戦略の 1 つは、薬物の再利用、つまり、すでに承認されている物質の治療特性を確立して新しい医療用途に使用することです。 この戦略はコンピュータ解析によってサポートされ、新しい治療薬の新規開発と比較してコストを削減し、プロセスをスピードアップし、活性化合物の膨大なライブラリをスクリーニングする最初の段階として機能します8、9、10、11、12。 薬物の再配置は、すでに COVID-1913 との戦いで使用されています。 ここでの例は、ウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）を標的とする抗ウイルス薬であるレムデシビルで、エボラ出血熱の治療に指定されたが、初期段階では回復時間の短縮と死亡率の低下に加え、新型コロナウイルス感染症患者の重篤な副作用を軽減する効果が示されている。勉強14． しかし、延長された臨床試験の後、WHO連帯試験コンソーシアムは、レムデシビルによる治療は入院中の新型コロナウイルス感染症患者の死亡を防げないか、あるいはほんの一部しか防げないと結論付けた。 この研究では、研究者らは他の再利用薬剤（ヒドロキシクロロキン、ロピナビル、インターフェロンβ1a）の有効性も評価した。 結果として、これらの薬剤は入院患者に全くまたはほとんど利益をもたらさず、入院時間、死亡率、人工呼吸の開始も短縮されませんでした15。 最近、２つの経口投与薬が市場に導入されました。 ファイザーの PF-07321332 (ニルマトレルビル) は SARS-CoV-2 Mpro 阻害剤であり、パクスロビッドという名前でリトナビルと組み合わせて販売されています (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04960202; [2021 年 9 月 21 日にアクセス) ]）。 2 番目の薬剤であるモルヌピラビルは、Merck と Ridgeback Biotherapeutics によって開発され、ウイルス RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRp) 阻害剤です (https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04939428; [2021 年 9 月 21 日にアクセス])。 それにもかかわらず、現在の治療選択肢は非常に限られており、新型コロナウイルス感染症患者の新たな治療法を見つけることは科学界にとって主要な課題となっている。

この問題に対処するために、科学者たちはウイルスの非構造タンパク質の中から創薬可能な標的を特定し、そのうちの 2 つはプロテアーゼでした。 SARS-CoV-2 の主要プロテアーゼ (Mpro、3CLpro、nsp5) とパパイン様プロテアーゼ (PLpro、nsp3 パパイン様プロテアーゼ ドメイン) は、ウイルスのポリタンパク質を処理し、ウイルスにとって重要な 16 nsps を生成することにより、宿主細胞内でのウイルスの複製を可能にします。レプリケーション。 SARS-CoV-2 Mpro は 13 個のウイルス NSPS を生成し、ウイルスの複製と成熟の過程で重要な役割を果たします 16、17、18。 Mpro は、ヒトコロナウイルスの間で高度に保存された構造を持つシステインプロテアーゼです。 溶液中では、酵素はモノマーとホモダイマーの両方として存在しますが、完全な触媒活性を有するのはプロテアーゼのホモダイマー型のみです 18、19、20、21。 基質切断部位の P1 位置にあるグルタミン残基に対する異常な優先性により、Mpro は既知のヒトプロテアーゼとは異なります。 この特徴は、副作用を最小限に抑えた効果的で広域スペクトルの抗ウイルス剤の設計と合成に有益です9、18、19、21、22、23。 SARS-CoV-2 PLpro は、その病態生理学的役割により、COVID-19 治療の優れた標的として提案されているウイルス システイン プロテアーゼです。 PLpro はウイルスのポリタンパク質を処理して nsp1 ～ 3 タンパク質を生成します。 さらに、プロテアーゼは、感染細胞内のタンパク質を脱ユビキチン化および脱ISG化することにより、宿主の免疫応答も変化させます24、25、26、27。 したがって、PLpro阻害はウイルスの複製をブロックするだけでなく、ISG15とユビキチンによって媒介される細胞シグナル伝達の調節不全も制限すると考えられる。

2-フェニルベンズイソセレナゾール-3(2H)-オン (エブセレン) は、1924 年に Lesser と Weiß によって初めて調製されました 28 は、細胞内で多面的な作用機序を持つ小分子薬です 29。 エブセレンは、セレノ酵素グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx) の模倣物として作用し、還元された TrxR30、31、32 の酸化によってチオレドキシン (Trx) システムと相互作用する優れた ROS スカベンジャーです。 GPx のような活動中、エブセレンは触媒サイクルに沿って配置された一連の反応を受けます。 データは、反応様式がチオールと過酸化水素の細胞濃度に依存することを示唆しています 30,33,34,35,36,37。 最近、エブセレンが両方の SARS-CoV-2 プロテアーゼを阻害することが示されました。 Weglarz-Tomczak et al. Ebselen とその誘導体のコレクションを PLpro の阻害剤として評価し、ナノモル範囲の IC50 値を持つ阻害剤の同定につながりました 38。 エブセレンとその誘導体は、SARS-CoV-2 Mpro に対するこれらの化合物の阻害効果を調査し、この酵素の触媒による Cys145 セレン酸の機構を提案した Amporndanai らの研究でも使用されています 39。 試験した化合物は、組換え酵素アッセイではマイクロモル未満の IC50 値を示し、細胞アッセイでは EC50 が低マイクロモル範囲の抗 SARS-CoV-2 活性を示しました。 さらに、抗ウイルスアッセイでは、エブセレン誘導体がエブセレンよりも優れていました。 別の研究では、約 10,000 の薬物および薬物候補のライブラリーが Mpro 阻害剤についてスクリーニングされました。 その結果、エブセレンは試験した物質の中で最も低いIC50（0.67μM）を示し、さらにSARS-CoV-2に感染したVero細胞においても抗ウイルス効果を示した9。 Caoらによる研究では、 研究者らは、NIH Clinical Collection 化合物ライブラリーの HTS を実行しました。 エブセレンは、細胞アッセイにおいて最も強力な抗コロナウイルス薬の 1 つでした 40。 Mangiavacchi らによって行われた研究では、ケルセチン誘導体の構造にセレン原子を導入すると、その抗ウイルス効力がケルセチンと比較してほぼ 24 倍増加することが示され、新規抗ウイルス薬の発見における有機セレン化合物の重要性が示されました 41 。

最近の研究では、エブセレンが SARS-CoV-2 による RNA キャップ グアニン N7-メチルトランスフェラーゼ 42 およびエキソヌクレアーゼ 43 nsp14 活性も阻害することが明らかになりました。 Nsp14 は、独立して機能する N7-メチルトランスフェラーゼ (N7-MTase) ドメインと nsp10 依存性エキソヌクレアーゼ ドメインを備えた二機能酵素です 44。 この酵素は、ウイルス転写物の安定性とタンパク質生合成に重要な、新しく合成されたウイルス mRNA の 5' 末端キャッピングに関与しています。 nsp14 N7-MTase の役割は、S-アデノシル-L-メチオニン (SAM) から 5' RNA 末端 (Gppp-RNA) に位置するグアノシン 5'-三リン酸の N7 位へのメチル基転移反応を触媒することです。 、その結果、cap-0 が形成されます 43。 ウイルス N7-MTase の阻害は、SARS-CoV44 を含むウイルス複製を抑制することがすでに示されています 45。 したがって、nsp14 酵素は抗ウイルス薬開発の良い標的と考えられています (図 1)46。

SARS-CoV-2 のライフサイクルを簡略化したもの。 ウイルスは宿主の細胞に侵入し、細胞質内でそのゲノムを放出します。 ウイルス RNA は 2 つのポリタンパク質、pp1a と pp1ab に翻訳されます。 次に、自己切断により、2 つのウイルス プロテアーゼ (PLpro および Mpro) が遊離されます。 それらの主な役割は、ポリタンパク質をさらに処理することであり、その結果、他の NSP が放出されます。 次に、nsps のグループが複製および転写複合体 (RTC) を形成します。 RTC はさらに、ウイルスの構造タンパク質と付属タンパク質の合成を担う一連のサブゲノム RNA (sg-RNA) だけでなく、ウイルスゲノム RNA (g-RNA) のコピーの生成にも関与しています。 ビリオンは小胞体とゴルジの中間コンパートメント (ERGIC) で組み立てられます。 g-RNA は構造 N タンパク質で覆われており、M、E、S 糖タンパク質を含む ERGIC に入ります。 その後、ビリオンはエキソサイトーシスによって放出されます 47,48。 Mpro、PLpro、および N7-MTase の阻害は、ウイルス複製の抑制につながる可能性があります。 プロテアーゼ阻害は nsps の生成を停止しますが、N7-MTase 阻害はウイルス RNA の安定した転写物の合成を防ぎます。 BioRender.com で作成されました。

エブセレンおよび他の有機セレン化合物の有効性は、HIV49、50、HSV251、HCV52、およびジカウイルス 53 感染症に対して以前に評価されています。 さらに、最近の報告では、エブセレンとその誘導体が SARS-CoV-2 PLpro38 の強力な阻害剤であると報告されています。 現在、エブセレンは中等度および重度の新型コロナウイルス感染症患者に対する経口治療薬として第 2 相臨床試験で評価されています (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04484025; https://clinicaltrials.gov/ct2/show) /NCT04483973; [2021 年 8 月 10 日にアクセス])。 この研究では、潜在的な抗SARS-CoV-2剤としてのエブセレン誘導体および類似体を調査しました。 エブセレンは毒性が低く、臨床試験が進行中であるため、リード化合物として魅力的です。 まず、23 種類のエブセレン誘導体と 11 種類のエブセレンジセレニド誘導体のコレクションをスクリーニングし、最も有望な 2-フェニルベンズイソセレナゾール-3(2H)-オンの半値阻害濃度 (IC50) 値を決定して、SARS-CoV-2 としての特性を評価しました。 PLpro 阻害剤と Mpro 阻害剤。 次に、Py-FLINT 蛍光アッセイを使用して、選択したエブセレン誘導体の組換え酵素に対する nsp14 N7-MTase 阻害特性を評価しました。 エブセレンの「開環型」であるビス[2-(N-フェニルカルバモイル)フェニル]ジセレニドは、生物体内のエブセレン触媒サイクル中の中間体の1つとして提案されており(図2を参照)、細胞環境においてこの化合物はエブセレンの貯蔵庫として機能する可能性がある。ウイルス酵素を阻害し、H2O2 および他の ROS54 に対する保護に関与する、対応するベンズイソセレナゾロン。 したがって、我々は、Vero E6細胞における11種類のビス[2-(N-アリールカルバモイル)フェニル]ジセレニドについて、RNA減少ベースのアッセイおよび細胞変性効果ベースのアッセイで抗SARS-CoV-2活性を測定した。 最後に、本発明者らは、エブセレンが、生体内での細胞毒性作用を最小限に抑えた新規抗ウイルス剤開発の潜在的なリード化合物を構成する可能性があることを示す。 この結果は、新型コロナウイルス感染症の治療に適用される、SARS-CoV-2によってコードされるプロテアーゼを標的とする新しい活性化合物の設計に役立つ可能性がある。

エブセレンの開放型（濃青色）の形成を含む、過酸化水素の還元を伴うエブセレンのもっともらしい触媒サイクル。

生物学的に活性な有機セレン化合物の合成は、世界中の多くの研究チームの範囲内にあります35,55,56。 エブセレンおよび他のベンズイソセレナゾール-3(2H)-オンは、これまでにいくつかの方法で調製されてきました57,58。 コレクションに含まれる化合物の構造を表 1 に示します。エブセレン、その誘導体 (1 ～ 23)、およびそれらの類似体 (24 ～ 34) の一般的な調製手順を図 3 に示します。ジセレニド（３６）は、アントラニル酸（３５）の連続的なプロトン化、ジアゾ化および二セレニド二ナトリウムまたは二リチウムのセレニル化の結果として得られた。 次のステップでは、ジセレニド 36 と塩化チオニルをベンゼン中、溶媒還流下、DMF の存在下で反応させることにより、条件に応じて塩化 2-(クロロセレノ)ベンゾイル (37) またはビス[(2-クロロカルボニル)フェニル] ジセレニド (38) を生成しました。使用した塩化チオニルの量。 乾燥 Et3N 塩基の存在下、無水 MeCN (DCM) 中で、アニリンまたはそのフェニル環置換誘導体と 2-(クロロセレノ) ベンゾイル クロリド (37) のタンデム セレニル化/アシル化反応 59 により、エブセレンとその誘導体 1 ～ 23 が得られました。 塩基として無水Na2CO3の存在下、無水DCM中、フェニル環置換アニリンと塩化物38とのアシル化反応により、エブセレン「二量体」形態の類似体25-3460が得られた。 特に、カルバモイルフェニルジセレニド 24 は、溶媒としてのメタノール中でヒドラジン一水和物を用いてエブセレンを還元することによって調製されました61。 LC-MS 分析によって確認されたとおり、化合物の純度は > 95% でした (補足情報を参照)。

エブセレン、その誘導体、およびそれらの「二量体」形成類似体 1 ～ 33 の調製。 試薬および条件: (a) (i) aq. HCl、(ii) NaNO2、− 7 〜 + 7 °C、(b) (i) NaSeSeNa、MeOH、NaOH または LiSeSeLi、THF、HMPTA、− 7 〜 + 5 °C、(ii) aq. HCl、(c) 7 当量 SOCl2、カタログ。 (DMF)、ベンゼン、還流、(d) RNH2、Et3N、MeCN または DCM、(e) 3.5 当量の SOCl2、cat. (DMF)、ベンゼン、還流、(f) RNH2、Na2CO3、DCM、(g) H2N-NH2・H2O、MeOH、還流。 (参考文献60、62、63、64に従って実施。

FT-IR スペクトルは結晶格子または KBr で測定され、1H-、13C-、77Se-、および 19F-NMR スペクトルは通常 DMSO-d6 で測定されました。 エブセレンとその類似体 1 ～ 23 の場合、カルボニル (C=O) 基の伸縮振動に対応する波数は約 1583 ～ 1649 cm-1、置換基 (CN) バンドを持つ窒素炭素単結合は 1305 ～ 1363 cm-1 でした。さらに、二セレン化物 24 ～ 34 の振動は、以前に報告されたデータ 60 と一致しています。 DMSO-d6 で測定された NMR スペクトルのベンズイソセレナゾール-3(2H)-one 領域では、化合物 1 ～ 23 のプロトン H-4、H-5、H-6、および H-7 共鳴が 7.85 で観察されました。それぞれ –7.94、7.45 ～ 7.51、7.52 ～ 7.78、および 8.05 ～ 8.12 ppm、炭素 C=O、C-3'、C-4、C-5、C-6、C-7、および C-Se共鳴は一般に、それぞれ 164.87 ～ 166.08、126.43 ～ 128.53、127.73 ～ 128.22、126.06 ～ 126.52、132.07 ～ 133.01、125.71 ～ 126.07、および 138.50 ～ 140.59 ppm で観察されました。ヘテロ芳香族と結合したフェニル置換基 (PhC- 1) 使用した置換基に応じて、119.7 ～ 146.3 ppm で共鳴が観察されました。 ベンズイソセレナゾロン (1 ～ 33 が 914.33 ～ 974.90 ppm で観察) およびジセレニド (25 ～ 34 が 443.48 ～ 447.93 ppm で観察) の 77Se-NMR 共鳴は、以前に公開されたデータ 64、65、66 と一致しています。 ベンズイソセレナゾロン 1、14、15、17、および 5 については、フッ化セレンのスピン-スピン結合定数 4J(77Se-19F) および 5J(77Se-19F) の値がそれぞれ 15.1 ～ 25.5 Hz および 10.7 Hz であることがわかりました。 6-7J(77Se-19F) のスピン-スピン定数は測定されませんでした。

まず、100 nM SARS-CoV-2 PLpro を含む 1 μM 阻害剤濃度、および 100 nM SARS-CoV-2 Mpro を含む 100 nM 阻害剤濃度で、エブセレンおよび化合物 1 ～ 23 の阻害特性を評価しました。 PLpro では、Ub および ISG15 タンパク質の C 末端エピトープと、nsp1/2、nsp2/3、および nsp3/4 切断部位に基づく構造を持つ Ac-LRGG-ACC 蛍光基質を使用しました。コロナウイルスのポリタンパク質。 Mpro には、新規テトラペプチド蛍光基質 QS1 (Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-ACC; KM = 207.3 ± 12 μM、kcat/KM = 859 ± 57 M−1 s−1)22 を使用しました。 PLpro スクリーニングの結果、エブセレンよりも高い効力を持つベンズイソセレナゾロン 7 のみが同定されました。 ただし、化合物 7 は、置換フェニル環の代わりに 3-置換ピリジニル部分を有する唯一の調査対象エブセレン誘導体であるため、コレクション内の他の化合物とは異なります。 Mpro の場合、最もヒットしたのは化合物 10 と 17 でした。化合物 10 はパラ位にニトロ基を持つ一置換誘導体を表しますが、17 は芳香環に 2-フルオロおよび 5-クロロ置換を持つ誘導体です。 我々は、2,4-ジメトキシ誘導体 16 が両方のプロテアーゼに対してエブセレンに近い効力を示すことを観察しましたが、エブセレンと比較して、A549 ヒト細胞株で評価されたその毒性は 10 分の 1 でした 60。 一般に、エブセレンのフェニル環内の置換は、エブセレンよりも効力が低い 3 つの化合物 (6、7、および 12) のみを同定したため、Mpro の阻害を促進します。 スクリーニング結果については、補足情報の表 S2 を参照してください39。

スクリーニング結果に基づいて、IC50 アッセイでのさらなる阻害特性評価のために、エブセレンとその誘導体 7 つを選択しました。 化合物を選択しました: (a) スクリーニングにおいて Mpro (10、17) または PLpro (7) に対して最も高い効力を示します。 または (b) 調査した両方のプロテアーゼに対して比較的高い阻害を示します (3、16、20、21)。 アッセイ中、PLpro の IC50 値はマイクロモル範囲でしたが、Mpro では低ナノモル範囲でした。 結果を表２に示す。参照阻害剤であるエブセレンについて、ＩＣ５０値は、ＰＬｐｒｏについては１．１２±０．０６μＭ、Ｍｐｒｏについては３０．９１±２．６７ｎＭであった。 PLpro 阻害剤スクリーニングアッセイで最もヒットした化合物 7 は、実際、試験した化合物の中で最も低い IC50 値 (0.58 ± 0.04 μM) を示しました。 エブセレンはスクリーニングアッセイにおいて 2 番目に優れた PLpro 阻害剤であるにもかかわらず、他の 2 つの化合物 (17、21) がわずかに低い IC50 値を示すことがわかりました。 最良の Mpro 阻害剤として分析のために選択された化合物 10 および 17 は、エブセレンよりも低い IC50 値を示しました。 ＩＣ５０＝１５．２４ｎＭを有する最も強力なＭｐｒｏ阻害剤は化合物１７であり、スクリーニング実験で２番目にヒットした。 興味深いことに、ベストヒット 10 は、3 および 21 で決定された値 (それぞれ 27.95 nM、25.69 nM、および 27.37 nM) と同様の IC50 値を示しました。 16 および 20 については、スクリーニングアッセイにおける効力がより高いにもかかわらず、これらの化合物について決定された IC50 値がエブセレンよりも高いことが観察されました。

IC50 はアッセイに依存する測定値です。 化合物に対して得られた低い IC50 値は、おそらく使用した基質の特性によるものと考えられます。 SARS-CoV-2 PLpro は脱ユビキチン化活性を有し、使用された Ac-LRGG-ACC 基質は比較的低い kcat/KM 値 (kcat/KM ≈ 900 s-1 M-1) を持っています。 この酵素の最適な基質は、ユビキチンまたは ISG15 分子に基づいています 26。 SARS-CoV-2 Mpro については、FRET 基質と比較して低い kcat/KM 値 (kcat/KM = 859 s−1 M−1) を持つ新規テトラペプチド QS1 蛍光基質を使用しました 22。

選択したエブセレン類似体 3、7、10、16、および 17 を、nsp14 N7-MTase に対する阻害特性についてさらに試験しました。 それらの IC50 値を決定するために、前述の蛍光アッセイ Py-FLINT42,67 を使用しました。 この目的のために、Py-FLINT プローブ (1 μM) を、SAM 共基質 (20 μM)、nsp14 酵素 (40 nM)、および 50 mM Tris-HCl pH 7.5 緩衝液中での半対数阻害剤希釈物と 30 °C でインキュベートしました。 反応の進行は、1 分の時間間隔で蛍光強度シグナルを記録することにより、96 ウェルセルでモニタリングされました。 初期反応過程を使用して、初速度 V の値を計算しました。 得られた初速度対阻害剤濃度の依存性から IC50 値を計算するために、可変ヒル勾配 p を仮定して 4 パラメーターの用量反応方程式を当てはめました (表 3、図 S2)。

最も強力な阻害剤 (化合物 3、7 およびエブセレン対照) では、高い値の丘の傾きが観察され、それらは適用された蛍光法の制限に起因すると考えられます。 競合実験で研究できる阻害の範囲は、タンパク質に対する蛍光プローブの親和性によって制限されます。 ミケリス・メンテン定数が低く、より優れた蛍光基質により、p ~ 1 で見られる強力な nsp14 阻害剤をよりよく区別できるようになると考えられます。化合物 3、7、および 16 は、ebselen に匹敵する IC50 値 (0.35 ～ 0.42 μM) を示し、これらの化合物は、 nsp14の強力な阻害剤。 4-ニトロフェニル (10) および 5-クロロ-2-フルオロフェニル (17) 置換を持つ化合物は、1 桁高い IC50 値を示しました (それぞれ 3.08 ± 0.46 μM および 3.83 ± 0.35 μM)。 同じ置換により、Mpro に対する阻害力の増加が引き起こされました。これは、フェニル環置換が化合物の選択性を調整するための可能な手段であることを意味します。 全体として、この結果は、エブセレンとその誘導体が SARS-CoV-2 タンパク質活性の多標的阻害剤として作用する可能性があることを示しています。

有機セレン化合物の生物学的活性についてより深い洞察を得るために、私たちは 11 種類のジセレニド (さまざまなエブセレン誘導体の開環型) のコレクションを研究に含めました。 まず、ベンズイソセレナゾール-3(2H)-オンに使用されるプロトコールに従って、PLpro 阻害剤と Mpro 阻害剤のスクリーニングを実行しました。 スクリーニングにより、ジセレニドが両方のプロテアーゼを阻害することが明らかになりました。 ジセレニドは一般にエブセレンよりも Mpro の阻害が弱かった。 ただし、ベンズイソセレナゾロンとは対照的に、PLpro では、ジセレニドは参照化合物よりも高い効力を示しました (完全なスクリーニング結果については、補足情報表 S3 を参照)。 プロテアーゼ阻害の IC50 パラメータは、化合物の疎水性が高く、アッセイ緩​​衝液中で沈殿するため評価できませんでした。 次に、Py-FLINT アッセイを使用して、ジセレニドの抗 N7-MTase 活性をテストしました。 試験した化合物はすべて、高ナノモル範囲または低マイクロモル範囲の IC50 値を示しました (表 4)。 2-フルオロ置換フェニル環を有する化合物 25 では、IC50 がエブセレンよりも 3 倍低い (0.12 ± 0.01 μM) ことが観察されました。 エブセレン 24 およびその 3-フルオロ置換誘導体 27 の「二量体型」も、エブセレンより約 2 倍低い IC50 を示しました。 これらの化合物の結果は、CPE および RNA ベースのアッセイにおける低い EC50 値と相関しています (表 5)。

組換え酵素を用いたインビトロアッセイでは、エブセレン、その誘導体、類似体が SARS-CoV-2 Mpro、PLpro、nsp14 に対する阻害活性を有することが示されました。 エブセレン ジセレニドがエブセレンの触媒サイクルに関与しており、酸化ストレスが SARS-CoV-2 感染に重要な役割を果たしていることが分かっているため 68、我々は、エブセレン類似体であるビス(2-カルバモイルアリール)フェニル ジセレニドも細胞内で抗ウイルス活性を有する可能性があると想定しました。 我々の次のステップは、Vero E6 細胞株のセルロにおける選択されたエブセレン類似体の抗ウイルス特性と細胞毒性の評価でした69。 この実験では、利用可能な二量体形態のエブセレン誘導体を含めました (構造を表 5 に示します)。 試験化合物の活性についてより深い洞察を得るために、細胞変性効果に基づくアッセイ、RNA 減少に基づくアッセイ、ウイルス力価減少アッセイ、および細胞毒性アッセイの 4 つの試験を実施しました。 CPE ベースのアッセイで EC50 が 20 μM を超える化合物は、RNA 低減ベースのアッセイおよびウイルス力価低減アッセイから除外されました。 ポジティブコントロールの抗SARS-CoV-2薬としてレムデシビルを使用しました。 エブセレン以外に、試験したすべての化合物の CC50 は 50 μM を超えており、一般的に細胞毒性が低いことが示されています。 さらに、エブセレンは、CPE ベースのアッセイにおいて 2 番目に高い EC50 を示しました。 しかし、エブセレン ジセレニド (ビス(2-カルバモイル)ジフェニル ジセレニド、24) については、最も強い抗ウイルス応答 (RNA 還元ベースのアッセイで EC50 = 1.0 ± 0.14 μM) と 3 番目に強い細胞保護効果 (EC50 = 1.5 ± μM) が観察されました。 CPE ベースのアッセイでは 0.13 μM)。 最も高い細胞保護効果は、ビス[2-(3-フルオロフェニルカルバモイル)]フェニル ジセレニド (27) で観察されました。これは、EC50 がナノモル範囲 (EC50 = 0.7 ± 0.13 μM) である唯一のジセレニドでした。 この化合物はまた、RNA 減少ベースのアッセイにおいて 2 番目に低い EC50 (1.5 ± 0.15 μM) で高い抗ウイルス活性を示しました。 もう 1 つの強力な化合物は、4-クロロおよび 2-フルオロ置換フェニル環を持つ 30 で、CPE ベースのアッセイで 2 番目に低い EC50 を示しました。 ほとんどの場合、メチル (32 および 33、対応する塩素) またはより大きな置換基 (28、31 - メトキシ、および 26、29 - トリフルオロメチル基) を持つジセレニドでは、細胞保護効果は低下するが、抗ウイルス活性は低下することが観察されました。フェニル環にハロゲン化物置換基のみを持つ化合物と比較して、大きな変化はありません。 しかし、5-クロロ-2-フルオロ置換フェニル環を有する化合物 34 は、他のハロゲン化物置換エブセレン ジセレニド誘導体と比較して、RNA 還元ベースのアッセイで最も高い EC50 を示し、CPE ベースのアッセイではかなり高い EC50 を示しました (25、 27、30）。 特にトリフルオロメチル基が化合物の活性を妨げ、CPE ベースのアッセイで最も高い EC50 値が得られることが観察されました。 ジセレニド誘導体の抗 SARS-CoV-2 効力は、EC90 濃度での最大ウイルス力価低下の測定によってさらに確認されました。 ウイルス力価低下は 0.3 ～ 3.3 log10PFU/mL の範囲であり、化合物 25 が最も優れたウイルス力価低下を示し、続いて化合物 24、34、および 30 でした。

新型コロナウイルス感染症による死者数は686万人を超えており、コロナウイルス疾患に対する広く利用可能で効果的かつ安全な治療法の必要性は公衆衛生にとって極めて重要である。 有望な戦略には Mpro 阻害が含まれており、このアプローチは新規の広域スペクトルの抗コロナウイルス薬につながる可能性があります 18。 最近、再目的化の取り組みにより、おそらく SARS-CoV-2 の主要プロテアーゼの阻害剤としての作用により、エブセレンが新型コロナウイルス感染症に対する潜在的な薬剤として同定されるようになりました9。 この概念は後に、ebselen39 による Mpro の触媒 Cys145 残基のセレン酸化機構を提案した Amporndanai らによって支持されました。 さらに、分子動力学シミュレーションを使用して、Menéndez et al. Mpro とエブセレン分子の間の非共有結合性相互作用を調査しました。 研究者らは、考えられる相互作用部位が 2 つあることを発見しました。1 つは活性部位内に位置し、もう 1 つは二量体形成に関与する領域にあります 70。 抗SARS-CoV-2剤としてのエブセレンの研究から得られた有望な結果は、研究者らに潜在的な抗ウイルス剤としてのその誘導体も探索するよう促した。 Węglarz-Tomczak et al. らは、PLpro プロテアーゼ阻害剤としてエブセレンとその類似体を研究しました 38。 喬ら。 らは、SARS-CoV-2 Mpro の阻害を改善する一連のエブセレン誘導体を設計および合成しました。 研究者らは、HPAepiC 細胞で実施した細胞抗ウイルス活性アッセイにおいてエブセレンよりも優れた 3 つの化合物を特定しました 71。 サンら。 Mpro 阻害剤としてエブセレン、エブ硫黄、およびそれらの誘導体を研究しました。 非還元条件では、すべての化合物が阻害特性を示しました。 しかし、DTT依存性スクリーニングアッセイでは阻害が減少したため、エブセレンは雑多なシステインプロテアーゼ阻害剤であり、細胞におけるその抗ウイルス活性は直接的なプロテアーゼ阻害の結果ではない可能性があるという結論につながりました。 プロテアーゼ阻害剤としてのエブセレンの役割は、還元剤の欠如においてエブセレンがさまざまなシステインプロテアーゼの活性部位に非特異的に結合することを示した Ma らによっても疑問視されている 72。 Wangらのグループによる別の研究では、プロテアーゼ-グロ・ルシフェラーゼおよびフリップ-GFPアッセイにおいて、エブセレンは細胞においてMpro阻害を示さなかった。 著者らは、組換え酵素を使用して in vitro FRET 基質アッセイを実施し、還元剤の存在下ではエブセレンがプロテアーゼを阻害しないことを示しました 73。 さらに、Flip-GFP アッセイを採用した研究者らは、293T-ACE2 細胞においてエブセレンによる SARS-CoV-2 PLpro 阻害が観察されなかった74。 細胞における Mpro 阻害は、細胞におけるプロテアーゼ阻害剤を評価するための新しい VSV ベースのアッセイを開発した Heilmann らによっても報告されていません 75。

エブセレンは、多くの生物学的標的に影響を与えるシステイン残基に対する反応性の結果である多面発現作用機序を持っています29、31、76。 エブセレンとその誘導体の高い抗ウイルス活性についてのもっともらしい説明の 1 つは、低レベルの ROS を維持するのに重要な GPx セレノ酵素の模倣物としての機能である可能性があります (図 2)。 酸化ストレスはウイルス感染において主要な役割を果たしており 77、したがって、有機セレン化合物などの抗酸化物質は有益な結果をもたらす可能性があります。 さらに、GPx1 アイソフォームは SARS-CoV-2 Mpro 細胞基質の可能性があると提案されているため、細胞内にエブセレンが存在すると酵素の枯渇に対抗することができます 78。 さらに、Du ら。 らは、SARS-CoV-2 Mpro 活性が酸化ストレスによって促進される可能性があることを示しました79。 したがって、エブセレンの抗酸化活性は間接的にSARS-CoV-2 Mproの活性を低下させることになるが、この概念にはさらなる研究と実験による確認が必要である。

有機セレニウム化合物は、チオール基に対する汎反応性により、高濃度では毒性を示す可能性があります 76。 しかし、エブセレンの臨床安全性は複数の研究で証明されており、この物質がさらなる構造最適化の有力な候補となっています。 エブセレンは、現在臨床では使用されていないが、ヒトでの臨床試験での使用歴がある物質を集めた NIH Clinical Collection 化合物ライブラリーに属しています。 ヒトにおけるその有効性と安全性は、さまざまな研究で評価されています。 人間の難聴の潜在的な治療法としてのエブセレンの第 I 相臨床試験では、患者は 1600 mg の単回投与に耐えました。 躁病または軽躁病の治療におけるエブセレンの第 IIa 相二重盲検プラセボ試験では、この薬は 600 mg の用量で 3 週間投与されました。 結果として、両グループの副作用は同等でした81。 エブセレンを 1 日 300 mg の用量で 2 週間投与することも、急性虚血性脳卒中を患う患者にとって安全であることが証明されました 82。 最終的には、その良好な薬物動態と安全性プロファイルにより、エブセレンは双極性障害におけるリチウム塩のより安全な代替品として研究されています83。

私たちの研究では、エブセレン誘導体および類似体のコレクションを利用して、それらの SARS-CoV-2 PLpro および Mpro 阻害特性を評価しました。 エブセレンは強力な nsp14 N7-MTase 阻害剤として特定されているため、SARS-CoV-2 nsp14 に対する当社の一連のエブセレン類似体も評価しました。 まず、有機セレン化合物のライブラリをスクリーニングしました。 次に、選択した化合物の IC50 値を決定しました。 最も強力な PLpro 阻害剤である 2-(3-ヒドロキシピリジン-2-イル)-1,2-ベンズイソセレナゾール-3(2H)-オンは、スクリーニングアッセイで最も高い効力を示し、最も低い IC50 値 (0.58 μM) を示しました。 IC50 の測定により、エブセレンと同様の阻害特性を持つさらに 2 つの化合物の同定が可能になりました。 これらの化合物は、スクリーニング中に低い効力を示したエブセレンの 2,4- および 2,5- 二置換誘導体でしたが、参照阻害剤よりもわずかに低い IC50 パラメーターも示しました。 Mpro に対する同様の分析により、スクリーニング中により高い効力とより低い IC50 パラメータを示す 4 つの化合物の同定が可能になりました。 それらのうちの 2 つはパラ位とオルト位に一置換フェニル環を持ち、2 つは二置換エブセレン誘導体でした。 エブセレンよりも約 2 倍低い IC50 値を持つ最良の阻害剤は、2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)-1,2-ベンズイソセレナゾール-3(2H)-オンでした。 試験したエブセレン誘導体の中で、我々は、エブセレンと同様のnsp14に対する阻害特性を有する、2-ブロモフェニルおよび2-(3-ヒドロキシピリジン-2-イル)修飾を有する化合物を発見した。

研究の別の部分は、エブセレンおよびそのジセレニド類似体の抗ウイルス活性および細胞保護活性の評価でした。 Vero E6 細胞で 12 種類のセレノ有機化合物とレムデシビル (陽性対照) をテストしました。 CPE および RNA 還元に基づくアッセイにより、このクラスの化合物が新しい抗ウイルス剤の有望な候補源となる可能性があることが明らかになりました。 ジセレニドの細胞毒性は一般に低かった (CC50 > 50 μM)。 我々は、エブセレン ジセレニドおよびフェニル環にハロゲン置換を有する 4 つのジセレニドのうち 3 つについて、CPE 還元ベースのアッセイにおける EC50 が最も低いことを観察しました。 エブセレン ジセレニドは、RNA 減少に基づくアッセイでも最も高い抗ウイルス活性を示しました。 より大きな基で置換すると、細胞保護活性が低下しました（CPE 還元ベースのアッセイでは EC50 が高くなりました）が、抗ウイルス活性については同様の効果は観察されませんでした。

この研究では、フェニル環内に置換やその他の修飾を加えたエブセレン誘導体が、非還元条件下で一般に、プロテアーゼと新型コロナウイルスによってコードされるN7-グアニンメチルトランスフェラーゼの両方に対して優れた阻害特性をin vitroアッセイで有することを示した。 さらに、エブセレン ジセレニド誘導体は、高い抗ウイルス活性と細胞保護活性を持っています。 この結果は、新しい治療法のための有望なプラットフォームを構成しており、このデータを使用して、新型コロナウイルス感染症の治療に使用される新しい抗コロナウイルス薬に向けた取り組みを促進できると考えています。

すべての溶媒は使用前に蒸留されました。 市販の試薬をさらに精製せずに使用しました。 Na2Se2 および Li2Se2 の調製に使用されるセレン粉末 (100 メッシュ) (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) の純度は 99.5% 以上でした。 エブセレンとその誘導体を調製する前に、新たに蒸留した MeCN を P2O5 で 2 回再蒸留しました。 エブセレンを水素化する前に、MeOHをLAHとCaH2の混合物上でゆっくり蒸留した。 エブセレン類似体 25 ～ 34 を調製する前に、CH2Cl2 (DCM) を P2O5 上で蒸留しました。 NaOH 上で蒸留したトリエチルアミン (Et3N) (POCh、ポーランド、グリヴィツェ) は、NaOH ペレット上で保存されました。 無水炭酸ナトリウム (Na2CO3) (POCh、ポーランド、グリヴィツェ) は、使用前に乳鉢で粉砕されました。 中間体である 2-(クロロセレノ)ベンゾイル クロリドとビス[(2-クロロカルボニル)フェニル] ジセレニドは、文献の手順に従って、重要な中間体である 2,2'-ジカルボキシジフェニル ジセレニドの形成を介して、アントラニル酸と元素セレンから調製されました60。 、61、63、64。 分取カラムクロマトグラフィーは、Merck Si60 シリカゲル (63 ～ 200 μm) で実行されました。 分析 TLC は、シリカゲル (Merck シリカゲル、60 F254) (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) でプレコートされた PET フォイル上で実行され、光 (λmax = 254 nm) またはヨウ素蒸気で染色することによって可視化されました。 。 融点は、標準的なオープンキャピラリー法を使用して、Electrothermal IA 91100 デジタル融点測定装置で測定しました。 IRスペクトル（4000〜400cm-1）は、Perkin-Elmer 2000 FT-IR分光計、またはダイヤモンドATRアクセサリを使用したフーリエ変換、Bruker VERTEX 70V分光計のKBrプレートに記録されました。 吸収最大値は波数 (cm-1) で報告されます。 1H-NMR および 13C-NMR スペクトル (それぞれ 300.1、399.8、600.6 MHz、および 75.48、100.5、151.0 MHz) は、Bruker DRX 300 (Bruker、ラインシュテッテン、ドイツ)、Jeol 400yh (Jeol、東京、日本) で記録されました。 Bruker Avance II 600 (ブルカー、ポズナン、ポーランド) の機器。 CHCl3-d1 および DMSO-d6 で記録された NMR スペクトルは、溶媒のそれぞれの残留 1H または 13C シグナルを参照し、化学シフト (δ) は百万分率 (ppm) で示され、結合定数 (J) は Hz で示されます。 。 19F-NMRおよび77Se-NMR(それぞれ376.2および76.24MHz)をJeol 400yh装置で収集した。 高分解能質量スペクトルは、Waters LCT Premier XE TOF 装置のエレクトロスプレー イオン化を使用して収集されました。

文献の手順は、ジセレニド リチウム 62、ジアリール ジセレニド 2484、2860、63、3160、32 ～ 3363、3660、64、3860、および 2-(クロロセレノ)ベンゾイル クロリド (37)60 の調製に適用されました。 既知の化合物の純度と均一性は、ebselen60、1 ～ 258、357、7 ～ 860、985、1186、1660、19 ～ 2263、2360、2487、2687、2863、2987、3160、32 ～ 3363 の mp を測定することで確認されました。 、3686、3788、および 3886、または ebselen57、357、1066、1186、1660、3160 の FT-IR スペクトル、1-258、759、60、863、1086、1186、 1660、19-2263、2360、2484、2863、3160、3263、および 1066 の 77Se-NMR スペクトル、および 1660 の HRMS とそれらの文献データとの比較。 すべての新しい 13、30、34、未特性セレン種、489、587、690、985、1291、1491、1592、17 ～ 1893、2592、2792、および分光学的に未特性セレン 26、2987 セレン種は完全に特性評価されました。 1H-NMR および 13C-NMR スペクトルにおける水素および炭素原子の位置は、dept-135 または COSY 実験、および異核多量子相関 (HMQC) および異核多重結合相関 (HMBC) の 2D-NMR マップ分析によって裏付けられました。 ）、核オーバーハウザー増強分光法（NOESY）（測定された場合）。 詳細な合成プロトコルおよび化合物の分光学的特性評価については、サポート情報を参照してください。

SARS-CoV-2 PLpro は記載どおりに調製されました26。 簡単に説明すると、pGEX6P-1-SARS-CoV-2PLpro を BL21 (DE3) コドンプラス大腸菌細胞に形質転換し、0.1 mM IPTG および 0.1 mM ZnSO4 を用いて 18 °C で一晩誘導しました。 GST 融合 SARS-CoV-2 PLpro は、標準プロトコルを使用して精製されました。 GST-PreScissionプロテアーゼを使用して4℃で一晩融合タンパク質を切断し、続いて脱塩し、新鮮なグルタチオンビーズを通過させて、切断されたGSTおよびGST-PreScissionプロテアーゼを除去した。 サンプルは、20 mM Tris-Cl pH 8.0、40 mM NaCl、および 2 mM DTT で平衡化した Superdex 200 pg サイズ排除カラム (GE) を使用してさらに精製しました。 ピーク画分をプールし、約 10 mg/mL まで濃縮し、後で使用するために液体窒素中で急速冷凍しました。

SARS-CoV-2 Mpro は、記載されているように組み換えによって生成されました18。 簡単に説明すると、Mpro の遺伝子を PGEX-6p-1 ベクターにクローニングし、Nsp4-Nsp5 切断部位と C 末端にそれぞれ PreScission 切断部位を持ち、本物の標的タンパク質を生成しました。 標的タンパク質の遺伝子は、BL21-Gold (DE3) (Novagen) 株の大腸菌で発現されました。 組換え生産された Mpro は、HisTrap FF (GE Healthcare) およびイオン交換クロマトグラフィー (Q FF、GE Healthcare) を使用して精製されました。 最後に、さらなる実験のために、高純度の標的タンパク質を緩衝液交換（20 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、pH 7.8）に供しました。

SARS-CoV-2 mRNA キャップ グアニン N7-メチルトランスフェラーゼ nsp14 は、以前に記載されているように調製されました 42。 簡単に言うと、nsp14 遺伝子を pET28 SUMO 発現ベクターにクローニングしました。 Nsp14 は、His タグ付き SUMO との融合タンパク質として、BL21 (DE3) RIL E. coli (Invitrogen) で過剰発現されました。 融合タンパク質を、HiTrap FFTM カラム (Cytiva) を使用して精製し、続いて HiTrap 26/10 Desalting カラム (Cytiva) にロードしました。 N末端タグ(6×His-Sumo)を除去するために、Sumoプロテアーゼ(MCLAB)を添加し、次いで、nsp14タンパク質を再びHisTrap FFTMカラムで精製した。 nsp14を含む素通り画分を収集し、N末端タグ(6×His-Sumo)およびHisタグ付きSumoプロテアーゼから分離した。 フロースルー画分をさらに最終的にSuperdex 75 pg HiLoad 26/600ゲル濾過カラム(Cytiva)で精製した。 nsp14を含む画分を30μMに濃縮し、急速冷凍し、50mM HEPES（pH8.0）、100mM NaCl、1mM DTT、10％グリセロールを含む緩衝液中で-80℃で保存した。

SARS-CoV-2 PLpro および SARS-CoV-2 Mpro の阻害剤の化合物ライブラリーの評価は、Corning 96 ウェル プレートで実行されました。 PLpro の場合、DMSO 溶液中の各化合物の 1 μL をウェルに添加しました。 次に、アッセイバッファー (50 mM Tris、5 mM NaCl、0.075% BSA、pH 7.5) 中で 37 °C で 10 分間プレインキュベートした酵素 79 μL を各ウェルに加えました。 酵素を化合物とともに 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 次に、アッセイ緩​​衝液中の20μLのAc-LRGG-ACC基質をウェルに添加した。 最終濃度は、酵素 100 nM、基質 10 μM、試験化合物 1 μM でした。 Mpro のアッセイでは、DMSO 溶液中の各化合物の 1 μL をウェルに添加しました。 次に、アッセイ緩​​衝液（50 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.3）94中の79 μLの酵素を各ウェルに添加し、プレートを室温で2分間インキュベートした。 次に、アッセイ緩​​衝液中の20μLのQS1基質をウェルに添加した。 最終濃度は、酵素 100 nM、基質 50 μM、試験化合物 100 nM または 1 μM でした。 測定は、Molecular Devices Spectramax Gemini XPS 蛍光分光計を使用して 37 °C で実行されました。 ACCフルオロフォアの放出を30分間モニタリングした(λex = 355 nm、λem = 460 nm)。 さらなる分析のために、進行曲線の直線範囲が使用されました。 測定は少なくとも二重に実施した。 結果は、標準偏差を伴う相対酵素阻害の平均値（阻害剤を含まない対照測定値と比較した％）として示された。 アッセイ中、ウェル内の最終 DMSO 濃度は < 2% でした。

IC50 を決定するために、調査したプロテアーゼの相対活性を、選択した阻害剤の少なくとも 11 の異なる濃度で評価しました。 初期化合物濃度は実験的に求められました。 アッセイバッファー（上記）での阻害剤の段階希釈を 96 ウェルプレートで調製しました（ウェルに各希釈液 20 μL）。 SARS-CoV-2 PLpro の場合、アッセイバッファー中で 37 °C で 10 分間プレインキュベートした酵素 60 μL をウェルに添加しました。 酵素を阻害剤とともに 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 次に、アッセイバッファー中の基質 (Ac-LRGG-ACC) 20 μL をウェルに加えました。 最終濃度は酵素 100 nM、基質 10 μM でした。 SARS-CoV-2 Mpro の場合、プレインキュベーションを行わずに 60 µL の酵素を添加しました。 酵素を阻害剤とともに室温で２分間インキュベートした。 次に、アッセイバッファー中の基質 (QS1) 20 μL をウェルに添加しました。 最終濃度は、酵素については 100 nM、基質については 50 μM でした。 測定は、Molecular Devices Spectramax Gemini XPS 蛍光分光計を使用して 37 °C で実行されました。 ACCフルオロフォアの放出を30分間モニタリングした(λex = 355 nm、λem = 460 nm)。 IC50 値は、非線形回帰 (用量-反応-阻害方程式) を使用して GraphPad Prism ソフトウェアで決定され、相対酵素活性対阻害剤濃度として表されました。 測定は少なくとも３回行った。 結果は平均値と標準偏差として表示されます。 アッセイ中、ウェル内の DMSO 濃度は < 2% でした。 IC50 グラフについては補足情報を参照してください。

nsp14 酵素に対するエブセレン類似体の IC50 パラメーターを決定するために、N7-MTase 活性研究用に設計された前述の Py-FLINT アッセイを使用しました 42,67。 Py-FLINT プローブ (1 μM) を、SAM 共基質 (20 μM)、nsp14 (40 nM)、および阻害剤 (半対数希釈 logCinh < - 2.5; 2 >) とともにインキュベートしました。 点蛍光測定 (λex = 345 nm、λem = 378 nm) は、96 ウェル黒色の非結合アッセイプレートで 30 °C で実行されました。 初期速度 V は、最初の 10 点 (10 分) に直線曲線を当てはめることによって計算されました。 得られた依存性 V(Cinh) に、次の 4 つのパラメーターの用量反応方程式を当てはめました。

ここで、A1 と A2 はそれぞれ下と上の漸近線です。 Cinh 阻害剤の濃度。 p はヒル係数、V/V0 は阻害剤を使用した場合の初期反応速度と阻害剤を使用しない場合の初期反応速度の比です。 カーブフィッティングと IC50 の計算には、GraphPad Prism ソフトウェアを使用しました。

抗SARS-CoV-2活性は、化合物がVero E6細胞（ECACC 85020206）においてウイルス誘発性細胞変性効果（CPE）を阻害し、SARS-CoV-2 RNAを減少させる程度を測定することによって測定した。 CPE ベースのアッセイでは、2% FBS、100 U/mL のペニシリン、および 100 μg のストレプトマイシンを含む DMEM 培地中の 5000 個の Vero E6 細胞を含む 384 ウェル プレートに、化合物の 2 倍段階希釈を 3 回ずつ加えました。 /mL (すべてメルク)。 1時間のインキュベーション後、SARS-CoV-2（hCoV-19/チェコ共和国/NRL_6632_2/2020株は、バイオセーフティレベル3の実験室でVero CCL81細胞[ECACC 84113001]を接種することにより鼻咽頭ぬぐい液から分離された）を感染多重度0.05で添加した。 IU/mL。 5% CO2、37 °C で 3 日間インキュベートした後、XTT 溶液 (Sigma-Aldrich) を 4 時間添加して細胞生存率を測定し、EnVision プレートリーダー (Perkin Elmer) を使用して吸光度を測定しました。 ウイルスの細胞変性効果を 50% 減少させるのに必要な薬剤濃度 (EC50) は、GraphPad Prism v.9.0.0 ソフトウェアを使用して、細胞生存率のパーセント対 log10 薬剤濃度のプロットからの非線形回帰を使用して計算されました。 RNA減少ベースのアッセイでは、化合物の2倍連続希釈物を、前日に上記と同じ培地に播種した20,000個のVero細胞を含む96ウェルプレートに三重に加えた。 1時間のインキュベーション後、感染多重度0.05 IU/細胞でSARS-CoV-2を添加した。 2時間後、ウイルスを除去し、新しい化合物を細胞に添加した。 細胞を 2 日間インキュベートした後、培地を RT-qPCR (COVID-19 用マルチプレックス RT-PCR、Diana Biotechnologies、チェコ共和国) のテンプレートとして使用しました。 SARS-CoV-2 RNA コピー数を 50% 減少させるのに必要な化合物濃度 (EC50) は、上記のように RNA コピー数のパーセンテージと log10 薬物濃度のプロットから計算されました。

選択した化合物の最大力価低下は、方程式 EC90 = 9√H × EC50 (H はヒル勾配) を使用して EC50 測定から計算された EC90 濃度で測定されました。 簡単に説明すると、選択した化合物の EC90 濃度を 24 時間前に播種した 20,000 個の Vero E6 細胞に 3 回添加し、1 時間インキュベートし、MOI = 0.05 IU/mL の SARS-CoV-2 を添加しました。 37 °C で 1 時間インキュベートした後、5% CO2 培地を除去し、EC90 の新しい化合物を添加し、37 °C、5% CO2 で 48 時間インキュベートしました。 レムデシビルは対照として含まれた。 力価の低下は、Vero E6 細胞におけるプラークアッセイによって測定されました。 簡単に説明すると、ウイルス上清を除去し、24 ウェル プレートで 10 倍段階希釈し、続いて 300,000 個の Vero E6 細胞を添加し、37 °C、5% CO2 で 4 時間インキュベートしました。 次に、懸濁液に DMEM 中の 1.5% (w/v) カルボキシメチルセルロースを重層し、37 °C、5% CO2 で 5 日間インキュベートしました。 インキュベーション後、細胞を 1 × PBS で 1 回洗浄し、ナフタレンブラックで 45 分間染色し、ddH2O で洗浄して風乾しました。 プラークを計数し、薬物なし対照と化合物ウイルス力価の差を、1mLあたりのlog10プラーク形成単位(PFU)として表した。

細胞毒性は、各化合物の 2 倍連続希釈物を Vero E6 細胞とインキュベートすることによって評価されました。 5% CO2中、37℃で3日間インキュベートした後、上記のようにXTT溶液を添加することによって細胞生存率を測定しました。 吸光度の５０％減少をもたらす化合物濃度（ＣＣ５０）を、上記のように吸光度のパーセンテージ対ｌｏｇ１０薬物濃度のプロットから計算した。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

α-アミノ酪酸

7-アミノ-4-カルバモイルメチルクマリン

ジクロロメタン

ジメチルホルムアミド

トリエチルアミン

ヘキサメチルホスホルアミド

アセトニトリル

ピレン系蛍光強度

S-アデノシル-1-メチオニン

テトラヒドロフラン

tert-ロイシン

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Xue、X.ら。 活性が強化された本物の SARS-CoV M(pro) の生産: タンパク質過剰生産のための新規タグ切断エンドペプチダーゼとしての応用。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 366(3)、965–975 (2007)。

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この研究は、ポーランド医学研究庁の独自プロジェクト (助成金 2020/ABM/SARS/1) およびポーランド国立科学センターの助成金番号 (2020/01/0/NZ1/00063) によって MD および ( UMO-2020/01/0/ST4/00124) JJ 宛 ドラッグ研究室は、欧州連合との協調融資によるポーランド科学財団の TEAM プログラム内で実施される「TEAM/2017-4/32」プロジェクトによって支援されています。欧州地域開発基金の下で。 ヒルゲンフェルト研究所での研究は、欧州連合の SCORE プロジェクト (助成契約 # 101003627)、ドイツ感染症研究センター (DZIF)、およびストラクチャー アンド エクセレンス基金を通じたシュレースヴィヒ ホルシュタイン州政府からも支援を受けました。ポッシール財団（リューベック）とリューベック大学との緊密なパートナーシップによるものです。 抗 SARS-CoV-2 活性の測定は、ERDF/ESF プロジェクト ChemBioDrug CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000729 および CAS の有機化学生化学研究所 (RVO 61388963) によって支援されました。 オルセン研究室は、CPRIT RR200030 および NIH R01 GM115568 および GM128731 によってサポートされています。 有機・医薬化学部門 - K20 (法定資金 82013902) への支援をしていただいたヴロツワフ科学技術大学に感謝します。

ヴロツワフ科学技術大学、ウィブのケミカル生物学およびバイオイメージング学部。 Wyspianskiego 27, 50-370, ヴロツワフ, ポーランド

ミコライ・ズムジンスキー、ヴィオレッタ・ルート、マルシン・ドラッグ

ヴロツワフ科学技術大学、ウィブの化学部、有機・医薬化学学科。 Wyspianskiego 27, 50-370, ヴロツワフ, ポーランド

カミラ・オレチ、ヤロスワフ・グランダ、ミロスワフ・ギルグ、マウゴルザタ・ブルダ＝グラボウスカ、ラファウ・カレタ

有機化学・生化学研究所、チェコ科学アカデミー、フレミンゴヴォ・ナム。 2、16610、プラハ、チェコ共和国

ミカラ・ズガルボワ & ヤン・ウェーバー

Center of New Technologies、ワルシャワ大学、Banacha 2C、02-097、ワルシャワ、ポーランド

レナータ・カスプジク & ヤチェク・ジェミエリティ

College of Inter-Faculty Individual Studies in Mathematics and Natural Sciences、University of Warsaw、Banacha 2C、02-097、ワルシャワ、ポーランド

レナータ・カスプツィク

リューベック大学分子医学研究所、Ratzeburger Allee 160、23562、リューベック、ドイツ

リンリン・チャン、シンユアン・サン、ロルフ・ヒルゲンフェルト

サンアントニオ大学テキサス健康科学センター生化学および構造生物学部、サンアントニオ、テキサス州、78229、米国

ゾンヤン・LV、ディガント・ナヤック、ショーン・K・オルセン

国立医薬品研究所、UL。 Chełmska 30/34、00-725、ワルシャワ、ポーランド

マルゴルザタ ケシク ブロダッカ

ドイツ感染症研究センター (DZIF)、ハンブルク リューベック ボルステル リームス サイト、リューベック大学、23562、リューベック、ドイツ

ロルフ・ヒルゲンフェルド

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MZ と MD が研究を計画しました。 MZ、WR、M.Zg。 調査を実施し、データを収集した。 KO、JG、MG、MB-G。 化合物のコレクション、MK-B.、LZ、XS、および RH を合成して提供し、SARS-CoV-2 Mpro 酵素を提供しました。 ZL、DN、SKOがSARS-CoV-2 PLpro酵素を提供し、MZ、WR、JWが阻害データを分析・解釈し、MZが原稿を執筆した。 著者全員が原稿を批判的に修正しました。

Mikolaj Zmudzinski または Marcin Drag への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Zmudzinski、M.、Rut、W.、Olech、K. 他。 エブセレン誘導体は、SARS-CoV-2 の必須タンパク質である PLpro および Mpro プロテアーゼ、および nsp14 グアニン N7-メチルトランスフェラーゼを阻害することにより、SARS-CoV-2 の複製を阻害します。 Sci Rep 13、9161 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35907-w

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受信日: 2022 年 4 月 11 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35907-w

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